研究者たちは以前、蛍光性または生物発光タンパク質レポーターのいずれかを発現する組換えインフルエンザウイルスを生成しました。インフルエンザウイルスにおけるレポーター遺伝子の単一発現の一部は、実験における使用を著しく制限しています。我々のプロトコルは、蛍光感と生物発光レポーター遺伝子の両方を発現するバイレポーターインフルエンザウイルスの使用を記述し、したがって、その限界を克服する。
この技術の主な利点は、インビトロおよびインビボ研究のための単一の組換えインフルエンザウイルスの使用である。この技術を行う場合、基質が速やかに代謝されるため、ルシファーゼ基質の迅速な注入およびマウスの取り扱いの適切な計画が重要である。また、生物発光シグナルの検出を改善するためにマウスのシェービングが推奨される。
マウスに感染するには、まず1X PBSでBIRFLUを調製する。接種まで氷の上にウイルスを維持します。つま先ピンチ反射がないかどうかを確認して、マウスが麻酔されていることを確認し、準備されたBIRFLU希釈で鼻腔内に接種します。
すべてのマウスがケージに戻す前に適切に呼吸していることを確認してください。イメージングソフトウェアを開いて[初期化]を押し、イメージングに使用するパラメータを設定します。BIRFLUに感染したマウスをモニタリングするには、胸を剃って生物発光シグナルの検出を改善する。
マウスを麻酔したら、22ゲージ針を用い、100マイクロリットルのNlucルシメラーゼ基質をレトロに投与し、PBSで1~10に希釈した。注射の直後に、胸を上に向けて隔離チャンバーに動物を置きます。次に、撮像器に隔離チャンバーを置き、ドアを閉め、画像を取得します。
イメージングの後、マウスをケージに戻し、完全に回復するまで監視します。イメージングソフトウェアROIツールを使用して、対象領域を指定して測定をクリックすることで、取得した生物発光データを分析します。マウス肺のex vivoイメージングを行うために、原稿の方向に従って肺を収集し、画像取得ソフトウェアを起動し、イメージング用のパラメータを設定する。
機械が初期化されたら、肺を黒い背景トレイに入れ、組織が互いに分離されていることを確認します。トレイをイメージャーに取り込み、ドアを閉じて画像を取得します。イメージング後、すぐに組織を取り除き、サンプルが同じ日に処理される場合は摂氏4度で氷の上に保管してください。
後で処理する場合は、ドライアイスのチューブに素早く凍結し、摂氏80度で保管してください。画像を処理するには、ROI ツールを選択し、各肺の周囲に関心のある領域を描画し、測定をクリックします。BIRFLUは、感染細胞におけるヴィーナス、ヌルク、NP発現レベルを決定することによって、インビトロで特徴付けられています。
金星とヌルクの発現はBIRFLUに感染した細胞でのみ検出され、NPは野生型PR8およびBIRFLU感染細胞の両方で発現する。模擬感染細胞では発現は認められない。さらに、Nluc活性は、感染後24、48、72、および96時間の組織培養上清において測定されている。
感染後24時間で早くも検出され、発現レベルは96時間で増加する。また、BIRFLUの複製動態が野生型PR8ウイルスに匹敵することを実証することもできる。BIRFLUは蛍光および生物発光レポーター遺伝子の両方を発現する能力を有し、これら2つの間の相関は、マウス肺のin vivoおよびex vivoイメージングを用いて評価することができる。
BIR蛍光に感染したマウスの肺は、生体内および蛍光ex vivoにおいて高い生物発光を示した。ウイルス力素および生体内のBIRFLUの遺伝的安定性も決定されている。マウス肺からのウイルスに関するプラークアッセイは、ウイルスがプラークを形成し、両方のレポーター遺伝子を発現できることを示した。
BIRFLUは、インフルエンザに対する抗ウイルスおよび中和抗体の有効性を評価するためにも使用できる。これらのアッセイからの出力はすべて互いに相関しており、迅速かつ簡単に行うことができます。
