Pesquisadores já geraram vírus recombinantes de influenza que expressam repórteres de proteína fluorescente ou bioluminescente. Parte de nossa única expressão de genes repórteres no vírus da gripe limita severamente seu uso em experimentos. Nosso protocolo descreve o uso do vírus da gripe bireporter que expressa genes de repórteres fluoresentes e bioluminescentes, e, portanto, supera sua limitação.
A principal vantagem dessa técnica é o uso de um único vírus recombinante da gripe para estudos in vitro e in vivo. Ao realizar essa técnica, a injeção rápida de substrato de luciferase e o planejamento adequado do manuseio de camundongos é importante, pois o substrato é rapidamente metabolizado. Além disso, a barba de camundongos é recomendada para melhorar a detecção de sinal bioluminescente.
Para infectar os ratos, comece preparando o BIRFLU em 1X PBS. Mantenha o vírus no gelo até a inoculação. Verifique se há ausência do reflexo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo para ter certeza de que o mouse está anestesiado, e inocula-o intranasalmente com a diluição BIRFLU preparada.
Certifique-se de que todos os ratos estão respirando corretamente antes de devolvê-los para suas gaiolas. Abra o software de imagem e pressione Initialize e, em seguida, defina os parâmetros que serão usados para a imagem. Para monitorar os camundongos infectados com BIRFLU, raspe o peito para melhorar a detecção do sinal bioluminescente.
Uma vez que os camundongos são anestesiados, use uma agulha de calibre 22 para administrar retro-orbitalmente 100 microliters de niuc luciferase substrato, diluído de um a 10 em PBS. Imediatamente após a injeção, coloque os animais na câmara de isolamento com o peito virado para cima. Em seguida, coloque a câmara de isolamento no instrumento de imagem, feche a porta e adquira imagens.
Após a imagem, devolva os ratos para suas gaiolas e monitore-os até que eles se recuperem completamente. Use a ferramenta ROI de software de imagem para analisar os dados de bioluminescência adquiridos, designando uma região de interesse e clicando na medida. Para realizar imagens ex vivo de pulmões de camundongos, colete os pulmões de acordo com as instruções do manuscrito, inicie o software de aquisição de imagens e defina os parâmetros para a imagem.
Uma vez que a máquina é inicializada, coloque os pulmões em uma bandeja de fundo preto, e certifique-se de que os tecidos estão separados um do outro. Introduza a bandeja no imager, feche a porta e adquira imagens. Após a imagem, remova os tecidos imediatamente e armazene-os no gelo a quatro graus Celsius se as amostras forem processadas no mesmo dia.
Se eles serão processados mais tarde, congele-os rapidamente em um tubo em gelo seco, e armazene-os a 80 graus Celsius. Para processar as imagens, selecione a ferramenta ROI, desenhe regiões de interesse em torno de cada um dos pulmões individuais e clique em medida. Birflu tem sido caracterizado in vitro pela determinação dos níveis de expressão de Vênus, Nluc e NP em células infectadas.
A expressão de Vênus e Niuc só é detectada em células infectadas pelo BIRFLU, enquanto o NP é expresso em células infectadas por PR8 e BIRFLU. Nenhuma expressão é observada em células infectadas por simulação. Além disso, a atividade de Niuc foi medida em supernantes da cultura tecidual aos 24, 48, 72 e 96 horas pós-infecção.
É detectado já em 24 horas após a infecção, e os níveis de expressão aumentam em 96 horas. Também pode ser demonstrado que a cinética de replicação do BIRFLU é comparável ao vírus PR8 do tipo selvagem. Birflu tem a capacidade de expressar genes de repórteres fluorescentes e bioluminescentes, e a correlação entre os dois pode ser avaliada usando imagens in vivo e ex vivo de um pulmão de camundongo.
Os pulmões de camundongos infectados com BIRFLU apresentaram alta bioluminescência in vivo e fluorescência ex vivo. Também foram determinadas virais e estabilidade genética do BIRFLU in vivo. Ensaios de placa sobre os vírus de pulmões de camundongos mostraram que o vírus pode formar placas e expressar ambos os genes dos repórteres.
O BIRFLU também poderia ser usado para avaliar a eficácia dos anticorpos antivirais e neutralizantes contra a gripe. A saída desses ensaios estava correlacionada entre si e são rápidas e fáceis de fazer.
