Los investigadores han generado previamente virus de la gripe recombinante que expresan reporteros de proteínas fluorescentes o bioluminiscentes. Parte de nuestra única expresión de genes reporteros en el virus de la gripe limita severamente su uso en experimentos. Nuestro protocolo describe el uso del virus de la gripe bireporterer que expresa genes de reporteros fluoresntes y bioluminiscentes, y por lo tanto supera su limitación.
La principal ventaja de esta técnica es el uso de un único virus de la gripe recombinante para estudios in vitro e in vivo. Al realizar esta técnica, es importante la inyección rápida de sustrato de luciferasa y la planificación adecuada del manejo de ratones, ya que el sustrato se metaboliza rápidamente. Además, se recomienda el afeitado de ratones para mejorar la detección de señal bioluminiscente.
Para infectar a los ratones, comience preparando el BIRFLU en 1X PBS. Mantener el virus sobre hielo hasta la inoculación. Compruebe la ausencia del reflejo de pellizcar del dedo del dedo para asegurarse de que el ratón está anestesiado, e inocularlo por vía intranasal con la dilución BIRFLU preparada.
Asegúrese de que todos los ratones estén respirando correctamente antes de devolverlos a sus jaulas. Abra el software de imágenes y pulse Inicializar y, a continuación, establezca los parámetros que se utilizarán para la creación de imágenes. Para monitorear a los ratones infectados con BIRFLU, afeite su pecho para mejorar la detección de la señal bioluminiscente.
Una vez que los ratones son anestesiados, utilice una aguja de calibre 22 para administrar retro-orbitalmente 100 microlitros de sustrato de Nluc luciferasa, diluidos de uno a 10 en PBS. Inmediatamente después de la inyección, coloque los animales en la cámara de aislamiento con el pecho hacia arriba. A continuación, coloque la cámara de aislamiento en el instrumento de imagen, cierre la puerta y adquiera imágenes.
Después de la toma de imágenes, devuelva los ratones a sus jaulas y monitoríelos hasta que se hayan recuperado por completo. Utilice la herramienta de ROI del software de imágenes para analizar los datos de bioluminiscencia adquiridos designando una región de interés y haciendo clic en la medida. Para realizar imágenes ex vivo de los pulmones del ratón, recoja los pulmones de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, inicie el software de adquisición de imágenes y establezca los parámetros para la toma de imágenes.
Una vez inicializada la máquina, coloque los pulmones en una bandeja de fondo negra y asegúrese de que los tejidos estén separados entre sí. Introduzca la bandeja en el imager, cierre la puerta y adquiera imágenes. Después de la toma de imágenes, retire los tejidos inmediatamente y guárdelos en hielo a cuatro grados centígrados si las muestras se procesarán el mismo día.
Si se procesan más tarde, congélalos rápidamente en un tubo sobre hielo seco y guárdelos a 80 grados centígrados. Para procesar las imágenes, seleccione la herramienta ROI, dibuje regiones de interés alrededor de cada uno de los pulmones individuales y haga clic en medir. BIRFLU se ha caracterizado in vitro por determinar los niveles de expresión de Venus, Nluc y NP en las células infectadas.
La expresión Venus y Nluc sólo se detectan en células infectadas por BIRFLU, mientras que NP se expresa en células infectadas por PR8 de tipo salvaje y infectadas por BIRFLU. No se observa ninguna expresión en las células infectadas por simulacros. Además, la actividad de Nluc se ha medido en sobrenadantes de cultivo de tejidos a las 24, 48, 72 y 96 horas después de la infección.
Se detecta tan pronto como 24 horas después de la infección, y los niveles de expresión aumentan a las 96 horas. También se puede demostrar que la cinética de replicación de BIRFLU es comparable al virus PR8 de tipo salvaje. BIRFLU tiene la capacidad de expresar genes de reporteros fluorescentes y bioluminiscentes, y la correlación entre los dos se puede evaluar utilizando imágenes in vivo y ex vivo de un pulmón de ratón.
Los pulmones de ratones infectados con BIRFLU mostraron alta bioluminiscencia in vivo y fluorescencia ex vivo. También se han determinado los títulos virales y la estabilidad genética de BIRFLU in vivo. Los ensayos de placa en los virus de los pulmones de ratón mostraron que el virus puede formar placas y expresar ambos genes de los reporteros.
BIRFLU también podría utilizarse para evaluar la eficacia de los anticuerpos antivirales y neutralizantes contra la gripe. La salida de estos ensayos se correlacionaron entre sí y son rápidas y fáciles de hacer.
