Forscher haben bisher rekombinante Influenzaviren erzeugt, die entweder fluoreszierende oder biolumineszierende Proteinreporter ausdrücken. Ein Teil unserer einzigen Expression von Reportergenen im Influenzavirus schränkt seine Verwendung in Experimenten stark ein. Unser Protokoll beschreibt die Verwendung von Bireporter-Influenza-Viren, die sowohl fluoresent als auch biolumineszierende Reportergene ausdrücken und damit ihre Begrenzung überwinden.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung eines einzigen rekombinanten Influenzavirus für In-vitro- und In-vivo-Studien. Bei der Durchführung dieser Technik, schnelle Injektion von Luziferase Substrat und die richtige Planung der Mäuse Handhabung ist wichtig, weil das Substrat schnell metabolisiert wird. Auch die Rasur von Mäusen wird empfohlen, um den Nachweis von biolumineszierendem Signal zu verbessern.
Um die Mäuse zu infizieren, beginnen Sie mit der Vorbereitung der BIRFLU in 1X PBS. Halten Sie das Virus auf Eis bis zur Impfung. Prüfen Sie, ob der Zehenkniffreflex fehlt, um sicherzustellen, dass die Maus beästhept ist, und impfen Sie ihn intranasal mit der vorbereiteten BIRFLU-Verdünnung.
Stellen Sie sicher, dass alle Mäuse richtig atmen, bevor Sie sie in ihre Käfige zurückbringen. Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware, und drücken Sie Initialize, und legen Sie dann die Parameter fest, die für die Bildgebung verwendet werden. Um die mit BIRFLU infizierten Mäuse zu überwachen, rasieren Sie ihre Brust, um den Nachweis des biolumineszierenden Signals zu verbessern.
Sobald die Mäuse anästhesiert sind, verwenden Sie eine 22-Messgerät-Nadel, um retro-orbital 100 Mikroliter Nluc-Luziferase-Substrat zu verabreichen, verdünnt ein bis zehn in PBS. Unmittelbar nach der Injektion die Tiere mit nach oben gerichteter Brust in die Isolationskammer geben. Legen Sie dann die Isolationskammer in das Bildgebungsinstrument, schließen Sie die Tür und erfassen Sie Bilder.
Nach der Bildgebung kehren Sie die Mäuse in ihre Käfige zurück und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig erholt haben. Verwenden Sie das ROI-Tool für die Bildgebungssoftware, um die erfassten Biolumineszenzdaten zu analysieren, indem Sie eine Region von Interesse und Klickmaß ausbilden. Um ex vivo Bildgebung der Mauslungen durchzuführen, sammeln Sie die Lunge gemäß den Manuskriptrichtungen, starten Sie die Bildaufnahmesoftware und legen Sie die Parameter für die Bildgebung fest.
Sobald die Maschine initialisiert ist, legen Sie die Lunge in eine schwarze Hintergrundschale und stellen Sie sicher, dass die Gewebe voneinander getrennt sind. Führen Sie das Fach in den Bildträger ein, schließen Sie die Tür und erfassen Sie Bilder. Nach der Bildgebung entfernen Sie das Gewebe sofort und lagern Sie es bei vier Grad Celsius auf Eis, wenn die Proben am selben Tag verarbeitet werden.
Wenn sie später verarbeitet werden, frieren Sie sie schnell in einer Röhre auf Trockeneis ein und lagern Sie sie bei 80 Grad Celsius. Um die Bilder zu verarbeiten, wählen Sie das ROI-Tool aus, zeichnen Sie Interessenbereiche um jede einzelne Lunge und klicken Sie auf Maß. BIRFLU wurde in vitro durch die Bestimmung der Venus-, Nluc- und NP-Expressionsniveaus in infizierten Zellen charakterisiert.
Venus- und Nluc-Expression werden nur in von BIRFLU infizierten Zellen nachgewiesen, während NP sowohl in Wildtyp-PR8- als auch in BIRFLU-infizierten Zellen exprimiert wird. In Mock-infizierten Zellen wird kein Ausdruck beobachtet. Darüber hinaus wurde die Nluc-Aktivität in Gewebekulturüberstandanten bei 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Infektion gemessen.
Es wird bereits 24 Stunden nach der Infektion erkannt, und die Ausdruckswerte erhöhen sich bei 96 Stunden. Es kann auch nachgewiesen werden, dass die Replikationskinetik von BIRFLU mit dem Wildtyp-PR8-Virus vergleichbar ist. BIRFLU hat die Fähigkeit, sowohl fluoreszierende als auch biolumineszierende Reportergene auszudrücken, und die Korrelation zwischen den beiden kann mit Hilfe von In-vivo- und Ex-vivo-Bildgebung einer Mauslunge beurteilt werden.
Die Lunge von mit BIRFLU infizierten Mäusen zeigte eine hohe Biolumineszenz in vivo und Fluoreszenz ex vivo. Virale Titer und genetische Stabilität von BIRFLU in vivo wurden ebenfalls bestimmt. Plaque-Assays zu den Viren aus der Mauslunge zeigten, dass das Virus Plaques bilden und beide Reportergene ausdrücken kann.
BIRFLU könnte auch verwendet werden, um die Wirksamkeit antiviraler und neutralisierender Antikörper gegen Influenza zu bewerten. Die Ergebnisse dieser Assays waren alle miteinander korreliert und sind schnell und einfach zu tun.
