Araştırmacılar daha önce floresan veya biyolüminesans protein muhabirleri ifade rekombinant grip virüsleri üretti. Grip virüsündeki muhabir genleri tek ifademizin bir parçası deneylerde kullanımını ciddi şekilde sınırlar. Protokolümüz, hem florhem biyolüminesans muhabir genlerini ifade eden ve bu nedenle sınırlandırılmasını aşan bireporter influenza virüsü kullanımını açıklamaktadır.
Bu tekniğin en büyük avantajı in vitro ve in vivo çalışmalar için tek bir rekombinant influenza virüsü nün kullanılmasıdır. Bu tekniği yaparken, luciferase substrat hızlı enjeksiyon ve fare işleme uygun planlama önemlidir, substrat hızlı bir şekilde metabolize çünkü. Ayrıca, farelerin tıraş biyolüminesans sinyal in saptama geliştirmek için tavsiye edilir.
Farelere bulaştırmak için BIRFLU'yu 1X PBS olarak hazırlayarak başlayın. Aşı olana kadar virüsü buzda saklar. Farenin anestezi aldığından emin olmak için ayak tutam refleksinin yokluğunu kontrol edin ve hazırlanan BIRFLU seyreltme ile intranasiye sini aşılayın.
Tüm farelerin kafeslerine geri dönmeden önce düzgün nefes aldıklarından emin olun. Görüntüleme yazılımını açın ve Initialize tuşuna basın, ardından görüntüleme için kullanılacak parametreleri ayarlayın. BIRFLU ile enfekte fareler izlemek için, biyolüminesans sinyalin tespitini geliştirmek için göğüs tıraş.
Fareler anestezi edildikten sonra, PBS'de 1 ila 10 arasında seyreltilmiş 100 mikrolitre Nluc luciferase substratını retro-orbital olarak yönetmek için 22 gauge iğne kullanın. Enjeksiyondan hemen sonra, hayvanları göğüsleri yukarı bakacak şekilde izolasyon odasına yerleştirin. Daha sonra izolasyon odasını görüntüleme aletine yerleştirin, kapıyı kapatın ve görüntüler edinin.
Görüntülemeden sonra, fareleri kafeslerine geri getirin ve tamamen iyileşene kadar onları izleyin. Bir ilgi alanı atayarak ve önlemi tıklayarak edinilmiş biyolüminesans verilerini analiz etmek için görüntüleme yazılımı Yatırım Getirisi aracını kullanın. Fare akciğerlerinin ex vivo görüntülemesini gerçekleştirmek için, el yazması talimatlara göre akciğerleri toplayın, görüntü edinme yazılımını başlatın ve görüntüleme parametrelerini ayarlayın.
Makine başharfe bulaştığında, akciğerleri siyah bir arka plan tepsiye yerleştirin ve dokuların birbirinden ayrıldığından emin olun. Tepsiyi görüntüleyiciye tanıtılın, kapıyı kapatın ve görüntü edinin. Görüntülemeden sonra, hemen dokuları çıkarın ve numuneler aynı gün işlenecekse, dört santigrat derecede buzüzerinde saklayın.
Daha sonra işlenecekse, onları kuru buz üzerinde bir tüpte hızlıbir şekilde dondurun ve 80 santigrat derecede saklayın. Görüntüleri işlemek için YG aracını seçin, her bir akciğerin etrafında ilgi alanları çizin ve ölçü'ye tıklayın. BIRFLU enfekte hücrelerde Venüs, Nluc ve NP ekspresyon düzeylerini belirleyerek in vitro karakterize edilmiştir.
Venüs ve Nluc ekspresyonu sadece BIRFLU tarafından enfekte edilen hücrelerde tespit edilirken, NP hem yabani tip PR8 hem de BIRFLU enfekte hücrelerde ifade edilir. Sahte enfekte hücrelerde ifade gözlenmez. Ayrıca, Nluc aktivitesi doku kültürü supernatants ölçüldü 24, 48, 72, ve 96 saat post-enfeksiyon.
Enfeksiyon sonrası 24 saat erken saptanır ve ifade düzeyleri 96 saat artar. Ayrıca BIRFLU çoğaltma kinetik vahşi tip PR8 virüsü ile karşılaştırılabilir olduğu gösterilebilir. BIRFLU hem floresan hem de biyolüminesans muhabir genlerini ifade etme yeteneğine sahiptir ve ikisi arasındaki korelasyon fare akciğerinin in vivo ve ex vivo görüntülemesi kullanılarak değerlendirilebilir.
BIRFLU ile enfekte farelerin akciğerleri vivo ve floresan ex vivo yüksek biyolüminesans görüntülenir. Birflu in vivo'nun viral titreleri ve genetik stabilitesi de belirlenmiştir. Fare akciğerlerinden gelen virüsler üzerinde yapılan plak tahlilleri virüsün plaklar oluşturabildiği ve her iki muhabir genini de ifade edebildiği ortaya çıktı.
BIRFLU ayrıca antiviral etkinliğini değerlendirmek ve grip karşı antikorları nötralize etmek için kullanılabilir. Bu tahlillerden elde edilen çıktılar birbiriyle ilişkiliydi ve hızlı ve kolay bir şekilde yapıldı.
