Микроаррей ДНК и РНК очень полезны для изучения взаимодействия нуклеиновых кислот и белков, но они также являются удобным методом для подготовки библиотек последовательности. Фотолитография позволяет синтезировать сотни тысяч уникальных последовательностей параллельно и в настоящее время является единственным прямым методом синтеза РНК на микроарреях. Фотолитографический синтез микроаррей на месте также может быть распространен на химически модифицированные олигонуклеотиды, например, с двумя главными флюоро пептидных нуклеиновых кислот.
Видя процесс изготовления микроаррей и обработки может помочь понять, как этот сложный механизм был разработан из хорошо известного стандартного синтеза твердой фазы ДНК. Начните эту процедуру с микроаррейного дизайна и функционализации слайдов, как описано в текстовом протоколе. Включите синтезатор ДНК УФ-светодиод и его охлаждающий вентилятор.
Прикрепите УФ-измеритель интенсивности в координационном центре входящего УФ-излучения и включите его. На компьютере запустите программное обеспечение WiCell Controller. Включите и инициализируйте микромерное устройство.
Загрузите файл белой маски, нажав правой кнопкой DMD, а затем выбрав изображение нагрузки. Нажмите правой кнопкой мыши на значок UVS и выберите уф-затвор открытым. Прочитайте значение мощности на измеритель интенсивности и подсчитайте 60 секунд.
Через 60 секунд прочитайте значение мощности снова и обратите внимание на начало и конечные значения. Закройте затвор, выбрав УФ затвор близко и выключите счетчик интенсивности. Рассчитайте среднее значение интенсивности УФ-излучения в милливаттах на сантиметр квадрата.
В программном обеспечении WiCell загрузите файлы задания, последовательности и протокола в соответствующих подок окнах, а затем нажмите кнопку отправки последовательности и протокольных файлов на синтезатор ДНК. Для сборки синтеза клетки поместите толстую прокладку перфтороэластомера на кварцевый блок клетки. Затем поместите просверленный, функциональный слайд микроскопа поверх первой прокладки, и убедитесь, что отверстия на слайдах соединяются с водой и розеткой трубки клетки синтеза.
Поместите вторую тонкую полиэтиленовую прокладку на пробуреную горку, окружающую два отверстия. Наконец, поместите второй, функциональный, но undrilled слайд на вершине второй прокладки. Теперь поместите 4-винтовой металлический каркас на верхней части собранной двойной субстратной ячейки Затяните винт к той же силе зажима с помощью отвертки крутящего момента.
Прикрепите вход и розетку к синтезатору ДНК. Премьер ацетонитрил мыть линии и проверить надлежащий поток ацетонитрила через субстраты. Измерьте объем ацетонитрила на линии отходов после семи циклов грунтовки ацетонитрила.
Этот объем должен быть два миллилитров. Прикрепите ячейку синтеза к фокусной плоскости поступающего УФ-излучения. В случае подготовки библиотеки, приложите дополнительный вход и розетку линии к задней части клетки и заполнить заднюю камеру с двумя миллилитров бетакаротина решения.
Начните синтез, сначала нажав на Run в программном обеспечении WiCell. При первом ожидании команды в файле задания нажмите на синтезатор ДНК. После синтеза регулярных микроаррей, отсоедините клетку от синтезатора и разберите клетку.
Используйте бриллиантовую ручку, чтобы вытравить номер синтеза на стеклянных слайдах. Вытравьте число на не синтезированном лице каждого слайда. Перенесите слайды в 50 миллилитровых центрифуг и храните в высушенной области до дальнейшего использования.
После синтеза библиотеки microarrays, сначала слейте бетакаротин раствор из камеры затем мыть камеру в два раза, протекая пять миллилитров хлорида метилена через перед сливом. Для депротекторной депротекторной ДНК наполните окрашивание стеклянной банки 20 миллилитров этанола и 20 миллилитров ЭДА. Поместите микроаррей только для ДНК вертикально в банку, закройте крышку и оставьте слайды для депротекирования в течение двух часов при комнатной температуре.
Через два часа, получить слайды с помощью пинцета и промыть их тщательно с двойной дистиллированной водой. Высушите горки в центрифуге микроармей в течение нескольких секунд, прежде чем хранить их в децикаторе. Для депротекторции РНК-микроаррея приготовьте сухой раствор из 20 миллилитров триэтиламина и 30 миллилитров ацетонитриля в 50-миллилитровой центрифуге.
Перенесите одну РНК-микроарейную горку в центрифугу, закройте крышку и оберните пластиковой уплотнительной пленкой. Аккуратно встряхните центрифугу трубку на орбитальном шейкере в течение одного часа и 30 минут при комнатной температуре. Затем снимите слайд и мыть дважды с 20 миллилитров сухого ацетонитрила перед сушкой в центрифуге микроаррей в течение нескольких секунд.
После первого шага депротекторной передачи РНК слайд в гидратный раствор гидрата, закройте крышку и оберните пластиковой уплотнительной пленкой. После двух часов нежно тряски на орбитальном шейкере, удалить слайд и мыть его дважды с 20 миллилитров сухого ацетонитрила. Затем высушите в микроаррей центрифуге в течение нескольких секунд.
Если РНК-микроаррей также содержит нуклеотиды ДНК, проступить третий шаг депротекторной. Добавить ДНК / РНК microarray в 50 миллилитров трубки, содержащей один к одному EDA-этанол раствор После 5 минут при комнатной температуре, удалить слайд, и мыть микроаррай в два раза с 20 миллилитров стерильной воды. Высушите горку в центрифуге микроаррей и храните в децикаторе.
В 1,5 миллилитровой стерильной микроцентрифуге трубки, подготовить буфер гибридизации, содержащий Cy3 помечены ДНК, как описано в текстовом протоколе. Смешайте и вихрем раствор. Тщательно поместите самоклеясь 300 микролитровую камеру гибридизации над областью синтеза на каждом слайде и пипетке в растворе гибридизации.
Обложка отверстия камеры с клеевыми точками и оберните весь слайд в алюминиевой фольге. Поместите микроаррей слайд в духовку гибридизации, накройте крышкой и дайте ему мягко вращаться при выбранной температуре гибридизации в течение двух часов. Через два часа отсоедините горку, удалите алюминиевую фольгу, вывечьте раствор гибридизации и аккуратно оторвите камеру гибридизации.
Перенесите слайды в центрифугу, содержащую 30 миллилитров не-stringent Wash Buffer. Встряхните энергично в течение двух минут при комнатной температуре. Перенесите слайд в центрифугу, содержащую 30 миллилитров строгого буфера для мытья, и встряхните энергично в течение одной минуты.
Наконец, перенесите слайд в центрифугу, содержащую 30 миллилитров final Wash Buffer. Встряхните в течение нескольких секунд. Высушите горку в центрифуге микроаррей.
Теперь поместите сухой микроаррей, область синтеза лицом вниз, в держатель слайда микроаррей сканера. Чтобы депротекировать и расщеплять библиотеки ДНК, погрузите слайд в раствор расщепления в 50-миллилитровую центрифугу. Закройте трубку и оберните пластиковой уплотнительной пленкой, прежде чем аккуратно вращаться в орбитальном шейкере в течение двух часов при комнатной температуре.
Через два часа, удалить слайд и мыть дважды с 20 миллилитров скрупулезно сухой ацетонитрил, прежде чем дать ему высохнуть. С помощью пипетки нанесите 100 микролитров стерильной воды на теперь различимую область синтеза. Труба раствор вверх и вниз несколько раз, прежде чем передать его в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки.
Повторите процесс и объединить microarray eluate в той же трубке. Испарите чип eluate до сухости, а затем переочистить в 10 микролитров нуклеазы свободных H2O. Здесь показаны результаты анализа гибридизации, выполненной на микроаррее, содержащем ДНК и РНК-версии последовательности 25mer.
Сканирование в появляется в зеленом формате, соответствующем возбуждению, спектр выбросов флуоресценции Cy3, с интенсивностью флуоресценции, зарегистрированной в произвольных единицах. Между экспериментами существует значительная изменчивость абсолютных значений флуоресценции. Показаны результаты трех независимых синтезов с использованием одинаковых параметров изготовления и одной и той же пост-синтетической обработки.
25mer ДНК, когда гибридизированы в дополнение к его дополнительной Cy3 помечены нити ДНК, даст флуоресценции сигналов, начиная от 20000 до 30000, очень редко выше или ниже. 25mer РНК, когда гибридизируется в том же Cy3 помечены ДНК дополнение, даст флуоресценции интенсивности на соответствующие функции, начиная от 15000 до 20000. Однако интенсивность флуоресценции дуплексов РНК/ДНК иногда опускается ниже 8000, когда соответствующие дуплексы ДНК/ДНК будут по-прежнему флуоресцией в пределах диапазона от 20 000 до 30 000.
В таких случаях результаты ДЛЯ РНК можно считать неоптимальными. Как и в случае с любым другим экспериментом на основе РНК, важно помнить, что РНК-микроаррей чувствительны к деградации и должны обрабатываться в стерильных условиях. Библиотеки нуклеиновой кислоты, собранные из микроаррей, могут быть использованы в секвенировании ДНК или РНК, а также в кодировании цифровой информации о ДНК.
NED производит интенсивный ультрафиолетовый свет, который не следует непосредственно рассматривать. Из-за этого рекомендуется носить защитные очки во время использования инструмента.
