Клеточные реакции на внешние раздражители в значительной степени зависят от набора белков, которые выражаются на поверхности клетки в данный момент. Соответственно, количество, субклеточная локализация и подраздимовый состав этих белков динамически контролируются. Здесь мы будем использовать подход к кормлению антителами для количественной оценки уровня поверхностных выраженных рецепторов в клеточных культурах, до тех пор, пока интернализация и рециркуляция возобновляются.
Это очень универсальный протокол, который предоставляет механистическую информацию о регуляции поверхностных выраженных белков. В нашем примере мы будем изучать рецепторы глутамина в первичных нейронах гиппокампа. Этот протокол может быть адаптирован к любому белку, обладая анагенным внеклеточным эпитопом, если антител нет, трансвекция помеченных конструкций может быть полезна как для маркировки, так и для изучения конкретных мутаций.
В наших примерах, мы используем антитела против эндогенных GluA1, и помечены Glu12 B.To начать эту процедуру, передача крышки скользит клеточной стороне до парафиновой пленки покрыты лоток, чтобы сохранить реагенты, и облегчить манипуляции. Сохранить и поддерживать кондиционированные средства массовой информации на 37 градусов по Цельсию для инкубации и мытья шагов. Инкубировать клетки с первичными антителами, разбавленных в условных средств массовой информации, при комнатной температуре, в течение 15 минут.
После этого используйте вакуумную пипетку, чтобы тщательно аспирировать антитела, содержащие средства массовой информации, и мыть клетки три раза с условным средством массовой информации. При изучении поверхности по сравнению с внутриклеточным рецептором выражение исправить клетки с параформальдегидом после этого шага, как указано в текстовом протоколе. Поддерживайте клетки в кондиционированных средствах массовой информации без антител, и вернуть их в инкубатор при 37 градусах по Цельсию, чтобы обеспечить интернализацию.
При изучении процесса интернизации, исправить клетки с параформальдегидом после этого шага, как указано в текстовом протоколе. Чтобы блокировать эпитопы на первичных антителах, прикрепленных к поверхности выраженных рецепторов, которые не были интернализированы, инкубировать клетки с неконъюгированных Fab анти-IgG фрагменты антител, разбавленных в условных средств массовой информации, в течение 20 минут при комнатной температуре. После этого, мыть клетки три раза с условными средствами массовой информации.
Инкубировать промытые колодцы с условным средством, содержащим 80 микромолейных династий, при 37 градусах по Цельсию, чтобы обеспечить рециркуляцию интернализированных рецепторов. После окончания модификации на живых клетках, мыть клетки один раз с PBS плюс. Добавить раствор 4%paraformaldehyde и 4% сахарозы в PBS в клетки, и инкубировать в капоте дыма при комнатной температуре в течение семи-восьми минут, чтобы исправить клетки.
Затем мыть клетки три раза с регулярными PBS. Добавить раствор 10%Нормальная сыворотка козы в PBS к клеткам, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы блокировать неспецифические сайты связывания. Далее, инкубировать клетки с флуоресцентно помечены вторичные антитела разбавленных в 3%NGS в PBS при комнатной температуре в течение одного часа, для обозначения первичных рецепторов этикетки антитела.
После этого, мыть клетки три раза с PBS. Чтобы начать маркировку внутриклеточных рецепторов, добавьте раствор 0,25%TritonX в PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти-десяти минут, чтобы пронизать клетки. Затем блок с 10%NGS при комнатной температуре в течение 30 минут.
При изучении поверхности по сравнению с общей, инкубировать клетки с тем же первичным антителом, используемым ранее, разбавленный 3%NGS в PBS, при комнатной температуре в течение одного часа, для обозначения внутриклеточных рецепторов. Затем, мыть клетки три раза с PBS. Этикетка со вторым флуоресцентно помеченным вторичным антителом, разбавленным в 3%NGS в PBS, при комнатной температуре в течение одного часа.
После этого мыть клетки три раза с PBS. Сначала аккуратно поместите крышку скользит, ячейка стороной вниз, на 12 до 15 микролитров соответствующих монтажных средств для установки клеток. Затем изувечение клеток на соответствующем конфокальцаторе и анализируйте клетки, изложенные в текстовом протоколе.
Этот протокол для изучения торговли рецепторами глутамата основан на дифференциальной маркировке рецепторов, выраженных на поверхности клетки, и тех, которые выражаются во внутренних мембранах. После получения конфокальных изображений, флуоресцентный сигнал может быть легко количественно, чтобы показать увеличение выражения поверхности, по отношению к внутриклеточной популяции, после химического LTP. Ни один сигнал для PSD-95 не может быть получен в не-проницаемых клетках, демонстрируя целостность плазменной мембраны.
Это указывает на то, что сигнал, полученный для поверхности GluA1 действительно соответствует поверхностным выраженным рецепторам. Важно отметить, что минимальный сигнал для интернализированного GluA1 можно наблюдать в условиях непроницаемой, показывая, что все поверхностные эпитопы заняты первоначальным раундом маркировки антител. Рецепторы, которые были интернализированы затем определены.
Это пример подчеркивает, что фосфорилирование GluN2B на S1480 способствует интернализации рецепторов. Как фосфомиметический мутант S1480E отображается гораздо более высокий коэффициент интернализации по сравнению с рецепторами дикого типа. Как и ожидалось, сигнал для интернализированных рецепторов в элементе управления не получен.
Далее идентифицируются переработанные рецепторы и интернализированные рецепторы. Коэффициент переработки показывает, что GluN2B S1480E не влияет на переработку NMDAR. В управлении, сильный сигнал можно наблюдать для поверхности выраженной GluN2B в отсутствии блокирования Fab.
Этот сигнал исчезает в культурах, обработанных Fab, демонстрируя, что протокол блокировки достаточен, чтобы полностью блокировать выраженные эпитопы поверхности, и что поверхностные сигналы, наблюдаемые после переработки, действительно соответствуют рецепторам, проданным обратно в плазменную мембрану. Текущий протокол является лишь одним из методов, доступных для изучения регулирования поверхностных выраженных белков. Другие подходы могут быть приняты для расширения или проверки данных, полученных здесь.
К ним относятся биохимические методы, как биотинилирование, методы визуализации жизни, или функциональные подходы, такие как электрофизиология или кальциевая визуализация. Мы используем PFA, чтобы заморозить локализацию рецепторов, однако PFA является известным канцерогеном, поэтому очень важно выполнить шаги с использованием PFA под капотом дыма, при ношении соответствующих СИЗ.
