Этот протокол описывает создание новой модели мыши для изучения грибка кожи, Malassezia, и его взаимодействие с кожей млекопитающих in vivo. В отличие от подходов in vitro, эта модель инфекции позволяет изучать врожденные и адаптивные иммунные механизмы против Malassezia в полной сложности и в ткани специфическим образом. Малассезия связана с различными кожными расстройствами, такими как атопический дерматит.
Понимание иммунного ответа на гриб может обеспечить новые стратегии для лечения таких частых и хронических воспалительных заболеваний кожи. Экспериментальная инфекция кожи с Malassezia обеспечивает долгожданную модель для изучения того, как кожа commensal грибы модулировать иммунную систему и тем самым повлиять на ход и тяжесть различных кожных заболеваний. Для подготовки Malassezia inoculum добавьте 10 миллилитров жидкой mDixon средней и от трех до пяти отдельных колоний Malassezia из пластины mDixon agar в стерильную 100-миллилитровую колбу Эрленмайера.
Затем поместите колбу при 30 градусах цельсия и 180 вращениях в минуту в течение 48-96 часов. Когда культура кремового цвета и мутная, перенесите два миллилитров культуры в стерильную двухмилитровую микроцентрифугную трубку и осадите дрожжи центрифугированием. Повторное распределение гранул в один миллилитр PBS для второй центрифугации с последующим повторное успение в один миллилитр свежего PBS с энергичной пипетки.
Разбавить подвеску Malassezia 20 до 50 раз с PBS, чтобы убедиться, что показания между 0,1 и один и измерить OD 600 на спектрометре. Aliquot том подвески Malassezia в PBS, что соответствует OD 600 из четырех в один стерильный две миллилитровые трубки на животное, чтобы быть инфицированы и осадок дрожжей центрифугации. Затем повторно посовесить гранулы в 200 микролитров родного оливкового масла.
Чтобы инициировать инфекцию Malassezia, подтвердите отсутствие реакции на педаль рефлекс в анестезировали шесть-восемь недель самка C57 Black6 мыши и применить мазь к глазам животного. Используйте калипер для измерения толщины двух различных областей обоих ушей, чтобы позволить расчет средней толщины на ухо. Затем нанесите небольшой кусок ленты на кожу одного уха, прежде чем быстро удалить ленту из кожи уха пять раз с помощью нового куска ленты каждый раз.
После зачистки используйте стерильную пипетку, чтобы нанести 100 микролитров подвески оливкового масла Malassezia на спинную сторону каждого уха и ввести 200 микролитров стерильных, предварительно подкожных растворов глюкозы в нухальную складку для поддержки метаболизма и регидратации. Затем позвольте мыши восстановиться на грелке в течение 30 минут с мониторингом, прежде чем вернуть животное в клетку. В соответствующих экспериментальных точек времени, использовать калипер для измерения двух различных областях каждого уха мыши, чтобы позволить расчет средней толщины на ухо.
Чтобы измерить грибковое бремя в инфицированной коже, добавьте 500 микролитров стерильных 0,05%NP40 в дистиллированной воде и автоклавный стальной шар диаметром пять миллилитров в одну двухми миллилитровую микроцентрифугную трубку на ухо и взвесьте каждую трубку на балансе. Затем, урожай уши от каждого животного у основания и поместить ткани в отдельные трубки NP40. Взвесить каждую трубку на балансе, чтобы определить вес каждого образца уха, прежде чем гомогенизации тканей уха в течение шести минут на 25 Герц.
Затем обойтись 100 микролитров каждого образца на mDixon агар пластин и распространять подвески однородно через агар до их перевернутой инкубации при 30 градусов по Цельсию. Здесь показаны репрезентативные изображения для роста Malassezia sympodialis в жидкой среде mDixon и на mDixon agar, как показано на фото. Увеличение толщины уха можно наблюдать после применения Malassezia furfur к коже, которая была нарушена барьером по сравнению с невозмутимой кожей диких мышей типа C57 Black6.
Действительно, количественная оценка увеличения толщины уха с течением времени показывает, что изменение толщины является значительным по сравнению с автомобилем обработанной кожи. Кроме того, грибковое бремя в коже уха на второй день после заражения Malassezia pachydermatis в 100-1000 раз превышает предел обнаружения. Malassezia, как правило, образуют агрегаты и не легко приостановить.
Таким образом, обеспечить гомогенизацию подвески масляного гриба путем обширного вихря. Дополнительные считывания могут включать в себя, гистологии для определения патологии кожи и изоляции иммунных клеток от кожи и слива лимфатических узлов для исследования противогрибкового иммунного ответа. Эта модель открывает возможности для изучения иммунного ответа против Malassezia и исследовать роль гриба как commensal в контексте различных кожных заболеваний.
В некоторых странах виды малассезии классифицируются как организмы BSL-2. Будьте уверены, чтобы следовать правилам ваших местных органов власти и использовать соответствующие меры безопасности.
