Этот подход может быть использован в моделях стресса эндоплазматического ретикулума клеточных систем путем манипулирования молекулярной экспрессией компонентов последующих пар. Основное преимущество этого метода заключается в устранении влияния парной передачи сигналов путем визуализации и измерения нейронных путей. Этот метод может способствовать пониманию молекулярной основы перехода между острой и хронической фазами стресса ER в различных моделях нейродегенеративных заболеваний, помимо ганглиозидоза GM2 Для начала препарируйте ткань под 20-кратным увеличительным стеклом двумя щипцами с тонким наконечником номер пять, отделяя лобную кору от мозговых оболочек.
Перенесите лобную кору в коническую трубку объемом 15 миллилитров и инкубируйте ткань с тремя-четырьмя миллилитрами трипсина ЭДТА в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия для химического переваривания. После этого трижды промойте его сбалансированным солевым раствором Хэнка без ионов кальция, магния и 0,1% глюкозы. Механически диссоциируйте ткань 10 раз, пипетируя вверх и вниз с помощью наконечника объемом 1 000 микролитров в DMEM плюс 10% FCS.
Центрифугируйте гомогенат при 100 г в течение одной минуты, соберите надосадочную жидкость и заполните оставшийся объем в 1 000 микролитров. Нанесите клеточную суспензию на чашки для клеточных культур с плотностью 520 клеток на квадратный миллиметр с двумя миллилитрами DMEM, содержащими 10% FCS, 1% пенициллина стрептомицина и 1% незаменимой аминокислотной добавки. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненной среде с 5% углекислого газа в течение двух часов.
Чтобы обеспечить дифференцировку нервных клеток, замените среду на нейробазальную среду без сыворотки с добавкой без сыворотки. Храните культуры при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа до обработки. Для отжига смешайте два одноцепочечных олигонуклеотида с комплементарными последовательностями в равных молярных количествах.
Нагрейте при температуре 95 градусов по Цельсию в течение двух минут. Перенесите образцы из теплового блока и разбавьте полученный продукт до конечной концентрации 0,5 мкмоль. Клонировать вставку шРНК в лентивирусный вектор pLKO.
3G, переварить один микрограмм вектора с ферментами рестрикции EcoR1 и PAC1. Аккуратно перемешайте пипеткой и инкубируйте реакцию в течение трех-четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия. Для лигирования перемешайте переваренный вектор и вставьте его в молярном соотношении 3:1.
Инкубируйте его с лигазой Т4 и буфером лигазы в течение ночи при температуре 16 градусов Цельсия. Далее смешайте компонент E.coli с общим объемом реакции лигирования и охладите его на льду в течение 15 минут. Поместите его в ванну с температурой 42 градуса Цельсия на две минуты, а затем снова охладите на льду в течение 15 минут.
Перенесите весь объем, подвергшийся тепловому удару, в 15-миллилитровую пробирку и дополните объем до 1000 микролитров жидкой средой Лурия-Бертани или L-B. Встряхните бактерии в течение 90 минут при температуре 37 градусов Цельсия в орбитальном шейкере со скоростью примерно 330 об / мин. Центрифуга, которая встречала 5 000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Откажитесь от 900 микролитров надосадочной жидкости и используйте оставшуюся надосадочную жидкость для ресуспендирования гранулы. Равномерно распределите суспензию бактерий по твердой пластине ампициллина L-B и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. Выберите одну колонию для переноса в 15-миллилитровую пробирку с 10 миллилитрами жидкой среды L-B и ампициллина.
Встряхните бактерии при температуре 37 градусов Цельсия при примерно 330 об/мин и центрифугируйте культуру, чтобы гранулировать бактерии при 5 000 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После выброса надосадочной жидкости сохраните бактериальную гранулу при температуре минус 20 градусов по Цельсию. За 24 часа до трансфекции посейте от 1 до 5 миллионов клеток HEK-293 в 100-миллиметровые чашки для культивирования.
Смешайте 14 мкг pKLO. 3G вектор со специфической вставкой, 10,5 мкг упаковочной плазмиды psPAX и 3,5 мкг плазмиды оболочки pMD2. G. Разведите 45 микролитров реагента для трансфекции плазмиды в 700 микролитрах среды с восстановленной сывороткой и выдержите в течение пяти минут при комнатной температуре.
Затем смешайте смесь ДНК с разбавленным реагентом для трансфекции плазмиды, аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. После трансфекции замените среду чашки для культивирования клеток HEK-293 на свежую среду и добавьте весь объем раствора ДНК по каплям. Осторожно качните чашку и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа в течение 48-72 часов, чтобы позволить шРНК достичь оптимальной трансдукции.
Соберите среду с лентивирусом и храните при температуре четыре градуса Цельсия. Отфильтруйте вирусную надосадочную жидкость с помощью нейлоновой мембраны размером 0,45 микрометра и аликвотируйте один миллиметр проточного слоя. Центрифугу по 17 000 г в течение четырех часов.
Выбросьте надосадочную жидкость и законсервируйте гранулы. Дайте невидимым гранулам высохнуть, а после высыхания храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Инфицируйте первичные культуры корковых нейронов специфическими олигонуклеотидами шРНК, нацеливаясь на три простых UTR кальциневрина A-альфа или CHOP, и инкубируйте их при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение одного дня.
После этого добавьте исходный раствор GM2 в среду чашки для культивирования в конечной концентрации два микромоляра и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 16, 24 и 48 часов. Зафиксируйте клетки 4%-ным параформальдегидом и 120-миллимолярной сахарозой в PBS на 20 минут при 37 градусах Цельсия, а затем промойте их PBS. Добавьте раствор для пермеабилизации на пять минут и смойте PBS.
Используйте 5% BSA, разведенный в PBS, в течение 45 минут, чтобы обеспечить блокировку. Затем инкубируйте с антителом против MAP2 при четырех градусах Цельсия в течение ночи. После двукратного промывания клеток PBS в конце инкубационного времени инкубировать со вторичным антителом в течение одного часа.
Установите стекла после промывки ячеек ПБС. После получения изображений с помощью эпифлуоресцентного инвертированного микроскопа загрузите изображение, чтобы получить ImageJ, и вычтите фон, нажав «Обработать», а затем «Вычесть фон». Нажмите «Изображение», «Настроить», «Порог», чтобы настроить минимальные значения, позволяющие различить путь и некоторые трассировки.
Удалите сомы, используя выделение от руки. Выберите «Трассировки» и нажмите «Редактировать», «Выделение», «Создать выделение». Получите ROI, нажав на клавиши Control и T выделения, и сохраните его.
Откройте исходное изображение. Нажмите на панель ROI Manager и выберите начальный ROI. Затем нажмите на исходное изображение.
Как только ROI прослеживается на изображении, нажмите клавиши Control и M, чтобы обработать статистический анализ. Здесь была предпринята попытка проверить, влияет ли подавление нисходящих компонентов 2pERK на переходную фазу развернутого белкового ответа в модели стрессовых клеток ER. Ген кальциневрина А-альфа и ген CHOP были подавлены двумя специфическими последовательностями шРНК в культуре клеток первичных нейронов в течение одного дня.
Выражение анализируется методом вестерн-блоттинга. Наблюдается четкое ингибирование стресс-опосредованного ER кальциневрина А-альфа и повышения уровня CHOP в нокдаун-клетках. Возможная связь ER-стресса, вызванного накоплением GM2, с дегенерацией нейронов была изучена путем проведения иммуноокрашивания MAP2 первичных культур нейронов.
Атрофия нейритов значительно увеличивается после индуцирования стресса ER путем инкубации GM2 через 16-48 часов. Подавление экспрессии кальциневрина А-альфа значительно усиливает атрофию нейритов, особенно через 16 часов накопления GM2 по сравнению с группами, не получавшими GM2. Таким образом, нокдаун кальциневрина А-альфа ускорял процесс дегенерации в нейронах, подтверждая эффект кальциневрина на выживание в ранней фазе развернутого белкового ответа.
И наоборот, нокдаун CHOP приводил к значительному уменьшению атрофии нейрита по сравнению с контрольной группой именно через 16-24 часа. клеточный протокол с надлежащей первичной культурой клеток и получением 90 или более процентов инфицированных клеток соответствующим лентивирусом. Поскольку потеря нейронного концевого аксона является первым шагом, который мы закладываем в нашем процессе, также можно оценить это, выполнив анализ.
Этот метод позволяет нашей группе и другим оценить некоторые молекулы как потенциальные терапевтические инструменты.
