Круглая инъекция сперматид может решить проблему репродукции у некоторых пациентов с необструктивной азооспермией, но ее эффективность очень низка. В нашем исследовании мыши использовались в качестве моделей для поиска методов повышения эффективности эмбрионального развития ROSI у мышей. Неполная статистика указывает на то, что во всем мире было рождено менее 200 человеческих плодов, зачатых с помощью ROSI.
Поворотный момент в понимании потенциала технологии ROSI произошел в 2015 году, когда Танака и его коллеги сообщили об успешном рождении 14 плодов с помощью технологии ROSI, что вселило новую уверенность в ее клиническом применении и осуществимости. В настоящее время основное внимание в исследованиях ROSI уделяется аномалиям в эпигенетических модификациях и аномальной активации ооцитов, в то время как точная идентификация данных круглых сперматозоидов также является проблемой. Эффективность разработки эмбрионов ROSI у мышей уже очень высока в нашей лаборатории, которая аналогична другим лабораториям.
Тем не менее, эффективность развития негрызунов, таких как люди, все еще очень нова. В будущем мы сосредоточимся на повышении эффективности развития негрызунов. Для начала введите внутрибрюшинно самке мыши в возрасте от 6 до 8 недель 7,5 международных единиц гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы в 17:00 и хорионического гонадотропина человека через 48 часов.
Убедитесь, что после инъекции не происходит контакта с самцами мышей. Усыпив мышь, вскройте ее брюшную полость. С помощью ножниц разрежьте маточные трубы рядом с обоими яичниками и поместите их в буфер М2, предварительно нагретый до 37 градусов Цельсия.
Под объективом 10X вертикального микроскопа найдите прозрачную, увеличенную часть фаллопиевой трубы. Затем с помощью одномиллилитрового шприца обезопасьте маточную трубу, разрежьте увеличенную часть, и соберите из ооцитов корональные кучевые комплексы. Чтобы удалить гранулезные клетки, поместите комплекс ооцитов в предварительно подогретый М2 операционный раствор, содержащий 0,1% гиалуронидазы, и осторожно продуйте через пероральную пипетку.
Перенесите ооцит последовательно в капли KSOMaa, чтобы промыть три раза, и поместите в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Для начала приобретите усыпленного самца мыши C57BL/6 в возрасте от 8 до 10 недель. Вскройте его брюшную полость и аккуратно иссеките ножницами придаток яичка возле яичка.
Поместите чашку с придатками яичек в среду M2 под объектив вертикального микроскопа с 10-кратным увеличением. И с помощью одномиллилитрового шприца аккуратно иссеките придаток яичка, чтобы сперматозоиды вытекли. Сифоньте стекающие сперматозоиды в суспензии на дно пробирки, содержащей 0,5 миллилитра М2-буфера.
Для выделения округлых сперматид перенесите рассеченное яичко в буфер М2. С помощью шприца объемом в один миллилитр аккуратно разрежьте белую мембрану под микроскопом, а затем отожмите и иссеките извитые семенные канальцы. После извлечения суспензии профильтровать с помощью сита с ячейками 400 меш и центрифугировать отфильтрованные ячейки.
Выбросьте надосадочную жидкость и инкубируйте клетки с 200 микролитрами Hoechst 33342 при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Поместите цитометрическую трубку, содержащую окрашенные клетки, в проточный цитометр. После регулировки напряжения выберите популяцию ячеек на основе прямого и бокового рассеяния.
Затем удалите спайки клеток в соответствии с прямым рассеянием и длительностью импульса запуска. Используя два канала детектирования под лазером с длиной волны 355 нанометров, отсортируйте круглые сперматиды и сохраните их при температуре четыре градуса Цельсия. Под микроскопом круглые сперматиды мыши имели диаметр около 10 микрометров и демонстрировали выпячивающуюся ядрышковую структуру посередине.
Для начала получите ооциты и круглые сперматиды от мышей. Затем подготовьте удерживающие и инъекционные иглы соответствующего диаметра. Поместите ооциты в капли M2 объемом 10 микролитров с цитохалазином B или без него для размягчения и хранения гамет.
Затем поместите круглые капли сперматид M2 и установите операционную чашку на микроскопический операционный стол. Отрегулируйте положение инъекции и зафиксируйте иглу. Используя поливинилпирролидон или ПВП, смочите и очистите иглу для инъекций.
Далее извлеките круглую сперматиду в иглу для инъекций. Поверните ооцит с помощью удерживающей иглы, чтобы сориентировать полярное тело ооцита в положении «12 часов». Затем осторожно поместите иглу для инъекции в положение «три часа» на ооците.
С помощью аппарата PiezoXpert создайте отверстие в пеллюцидной зоне ооцитов. Затем осторожно введите инъекционную иглу в ооцит горизонтально и разорвите ооцитную оболочку. Постепенно вводите круглую сперматиду в цитоплазму ооцита.
Извлеките иглу для инъекции и аспирируйте небольшое количество оболочки ооцитов рядом с отверстием, чтобы запечатать ее. Для интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов поместите сперматозоиды на взлетно-посадочную полосу PVP. Отсадите сперматозоиды из хвоста и расположите его шейку у устья инъекционной иглы.
Нанесите пьезо, чтобы отделить головку сперматозоида от хвоста. Затем введите сперматозоид в ооцит, как было показано ранее, с помощью инъекционной иглы диаметром от 9 до 10 микрометров. Для вспомогательной активации ооцитов поместите ооциты в капли объемом 20 микролитров среды CZB, не содержащей кальция и магния, содержащей гексагидрат хлорида стронция.
Затем перенесите их в культуральную среду KSOMaa для выращивания. Одновременно создать группу для активации партеногенеза без введения круглых сперматид или сперматозоидов для эмбриологических исследований. После активации переложите в культуральную среду КСОМаа для культивирования.
Круглые эмбрионы, введенные сперматидами, показали меньшую эффективность развития по сравнению с эмбрионами, введенными интрацитоплазматическими сперматозоидами.
