Протокол облегчает вскрытие GFP помечены косвенные мышцы полета из Drosophila в разное время во время развития куколки для оценки изменений в гене и экспрессии белка. Используя эти методы, высокий обогащенный образец мышц полета с минимальной деградацией белка РНК может быть достигнут, что подходит для RT-PCR, западные помарки, или омические подходы. Эти специализированные вскрытия требуют практики и мастерства, но количество куколок, которые могут быть вскрыты и качество образцов улучшить с опытом.
Визуальная демонстрация этого вскрытия имеет решающее значение для определения того, как отличить летные мышцы от немишечных тканей и облегчения быстрой изоляции летных мышц от щенков. Для того чтобы повесять куколки, используйте смоченные кисти для того чтобы собрать и перенести pre-pupae в тарелку Петри 60 миллиметров, и секс куколки под бинокулярным микроскопом. Самцы идентифицируются по наличию яицы, которые появляются как полупрозрачные глобусы на в противном случае непрозрачные куколки.
После маркировки блюдо со временем, датой и генотипом мух, возраст куколок в 25 до 27 градусов по Цельсию инкубатор до соответствующей стадии. Для вскрытия IFM до 48 H APF используйте смоченную кисть, чтобы передать надлежащим образом поставленные куколки в черное рассеченное блюдо около 2/3, наполненное охлажденным PBS. Под флуоресцентным рассечением микроскопа используйте 5 типсов, чтобы подтолкнуть одну из куколок к нижней части черного рассечения.
Отрегулируйте масштаб микроскопа и сосредоточьтесь до тех пор, пока куколки не будут четко визуализированы. Используя одну пару типсов, чтобы схватить переднюю часть куколки, ткните куколок одним кончиком второй пары типсов, слегка вне центра живота, сразу за грудной клеткой. Используйте первую пару щипец, чтобы удалить переднюю половину куколки случае, и ущипнуть подвергаются куколки сразу за грудной клеткой, чтобы отделить живот от грудной клетки.
Затем аккуратно сожмите переднюю часть грудной клетки, чтобы разоблачить флуоресцентно помеченные IFM. Затем используйте типсы, чтобы выбросить оставшуюся тушу на противоположную сторону блюда и таким же образом вскрыть последующие куколки. Когда все куколки были вскрыты, используйте типсы для сбора волокон IFM, и организовать волокна в кучу на дне черного рассечения блюдо.
Используйте типсы, чтобы вытолкнуть любой мусор из поля зрения, и удалить любые не-IFM мышцы, жир, кутикулы, или другие нежелательные ткани из образцов. Затем используйте обрезанный наконечник пипетки для переноса груды IFMs в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую 250 микролитров охлажденного PBS. Для вскрытия IFM после 48 H APF используйте слегка смочеченную кисть для переноса постановочных куколок на полосу двусторонних липких лент, установленных на слайде микроскопа.
Ориентация куколок в линию, брюшной стороне вниз, и передней к нижней части слайда. Когда все куколки были помещены, использовать миппы, чтобы дразнить друг от друга и открыть первый корпус куколки над передней spiracles, и осторожно слайд пару типсов dorsally, к задней, резки куколки случае, как миппы двигаться. Освободите куколки из открытого корпуса и немедленно перенесите куколки на каплю PBS на втором слайде микроскопа.
Когда все куколки освобождаются, используйте тонкие ножницы, чтобы сократить живот куколок от грудной клетки, и нажмите животы в отдельную кучу. Когда все грудной клетки были удалены, использовать кусок бумаги, чтобы удалить большинство PBS и кучу животов. Добавьте каплю свежего, охлажденного PBS к оставшимся грудной клетке, прежде чем использовать ножницы, чтобы вырезать из головы вдоль продольной оси тела в одном движении, чтобы разделить грудную клетку пополам.
Когда все куколки были вскрыты, используйте 5 типсов, чтобы выбрать один из полушарий, и аккуратно вставьте кончики одного типса выше и ниже середины МФМ. Холдинг первой пары типсов еще, использовать тонкие ножницы, чтобы сократить один конец IFM от кутикулы и сухожилий, прежде чем вращать куколки 180 градусов, чтобы другой конец IFM быть вырезаны из кутикулы и сухожилий. Используйте типсы для передачи пучка IFM от грудной клетки к краю пузыря PBS, используя натяжение воды, чтобы держать пучок на месте.
Затем нажмите тушу на противоположную сторону слайда, и вскрыть остальные IFMs таким же образом. Когда все IFMs были собраны, используйте 5 типсов, чтобы удалить любые мышцы прыжка или кутикулы фрагменты, которые, возможно, нашли свой путь в образцах. Затем используйте натяжение воды, чтобы аккуратно захватить вскрытые МФМ между парой типсов, и поместите МФМ в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую 250 микролитров охлажденного PBS.
данные секвенирования мРНК от BRUNO1 IR IFM показывают изменения в экспрессии на уровне генной единицы по сравнению с данными секвенирования дикоготипа. Используя всю спектрометрию массы протеома на вскрытых МФМ, аналогичная регуляции наблюдается на уровнях белка и белка изоформа. После вставки линии белковой ловушки в окончательный интрон Mhc, включение GFP помечены белка можно наблюдать в IFM как две точки по обе стороны от M-линии на 90 H APF, в то время как в мышечной ткани ног сигнал GFP можно наблюдать равномерно через саркомер M-линии.
При использовании RT-PCR на вскрытом IFM, Mhc изоформный переключатель от GFP помечены exon 34 до 37 событие неописуемого exon 34 до 35 событие, могут быть обнаружены между 30 и 48 часов после образования пупариума при 27 градусов по Цельсию. Из данных по секвенированию мРНК, тканей мышц ног и скачков выражают все три изоформы MHC, поддерживая экспрессию изоформы с маркировкой GFP в зрелых мышцах. Оба Spalt основных мутантов и BRUNO1 IR-IFM, не удалось отключить выражение GFP помечены MHC isoform, как они развиваются, в результате чего изоформный профиль выражения напоминающие ноги и прыгать мышечной ткани.
Помните, что вскрытия должны быть выполнены менее чем за 30 минут, чтобы предотвратить деградацию РНК. И, чтобы заботиться, чтобы ограничить загрязнение другими типами клеток. Этот метод генерирует IFM-обогащенные образцы, пригодные для биохимических подходов, таких как RT-PCR, или западные blotting, а также подходы к омическому стилю, такие как масс-спектрометрия, секвенирование высокой пропускной способности, улавливание конформации хроматина и метаболомика.
Эти вскрытия могут дополнять мощные генетические подходы в Дрозофиле системными данными для изучения фундаментальных механизмов развития и регуляции генов.
