Этот метод обеспечивает эффективную стратегию для подготовки функциональных лесов для исследования опухоли костей. Децеллюляризованная костная экстрацелюлярная матрица, показанная переменная серосовместимость для выживания и деятельности остеосаркомовых клеток. Основным преимуществом этой техники является то, что остеосаркома клетки культуры в кости полученных матрицы показывают очень неоднородной морфологии похож на клинической остеосаркомы гистопатологии.
Метод обеспечивает идеальную модель для изучения развития, прогрессирования чувствительности препарата к опухолям костей, таким как остеосаркома, саркома Эвинга и другие злокачественные опухоли метастазы в кости. Для начала, получить от четырех до шести недель BALB / C мышей, после усыплять мышь с помощью стерильных хирургических ножниц, отрезать свежие малоберцовой кости, голени и бедренной кости от задней конечности. С помощью пинцета снимите эпителиальной ткани, а затем удалить как можно больше мягких тканей, как это возможно.
Промыть кости ног стерильным раствором 10 мМ PBS дважды, чтобы удалить кровь в шестисемейной тарелке. Погрузите кости в блюдо с 75%ethanol в течение трех минут, а затем промыть PBS дважды. Храните чистые кости в стерильной 50-миллилитрной центрифуге трубки со стерильной трубкой PBS при 80 градусах по Цельсию.
Оттепель замороженных костей при комнатной температуре, а затем заморозить снова на 80 градусов по Цельсию в течение одного часа. Подай кости к более чем двум циклам замораживания-оттепели для клеточного лиза и распада тканей. Затем поместите кости в стерильную 50-миллилитровую центрифугу, наполненную 0,5 нормальной HCl и инкубировать на ночь при комнатной температуре на орбитальном шейкере с нежной тряской, чтобы обеспечить полное и даже покрытие костей.
После наклейки, декант соляной кислоты раствор полностью и промыть кости под проточной водой в течение одного часа. Затем используйте дистиллированную воду для мытья костей дважды в течение 15 минут за стирку на орбитальном шейкере. Полностью декант решения.
Чтобы извлечь липиды в деминерализованных костей, поместите кости в 50 миллилитровую центрифугу трубки с 1:1 смесь метанола и хлороформа. Оберните трубку фольгой, чтобы избежать света для предотвращения разложения хлороформа. И поместите трубку на орбитальный шейкер на один час.
Затем используйте пинцет для переноса костей в другую трубку метанола с фольгой в течение 30 минут. Полностью удалите метанол и дважды промыть дистиллированной водой в течение 15 минут на орбитальном шейкере. Декант окончательно мыть воду и действовать в стерильном состоянии.
Промыть кости в шестиметровой тарелке стерильным PBS в течение трех минут. Добавьте 40 миллилитров стерильного раствора 0,05%TE в 50-миллилитровую центрифугу и инкубировать кости в течение 23 часов в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах Цельсия. Отбросьте раствор TE и дважды промойте стерильным PBS, дополненным 90 г/мл ампициллина и 90 г/мл канамицина в течение 15 минут каждый на орбитальном шейкере.
После декантирования окончательного мыть полностью, пополнить снова с 40 миллилитров стерильных PBS с антибиотиками. Тщательно вымойте в течение 24 часов при комнатной температуре с нежной тряской для достижения эффективной стерилизации пористых пространств. Затем перенесите кости в 50-миллилитровую центрифугу, наполненную стерильным PBS с антибиотиками.
Подготовленная костная внеклеточная матрица может храниться при четырех градусах цельсия в течение двух месяцев. Погрузите BEM в 75%ethanol в тарелку и аккуратно встряхните блюдо вручную в течение 30 секунд. Затем промыть PBS в течение 30 секунд, дважды.
Перенесите BEM на чистую шестиястную пластину культуры клеток. Добавьте два миллилитров полной культуры среды к каждому хорошо. Инкубировать BEM на ночь в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию.
Получить человеческие линии клеток ОС в 100 микролитров предварительно разогретых PBS, содержащих индикатор фенол красный. Используйте пипетки, чтобы приостановить ячейки ОС с приблизительной концентрацией 1 раз от 10 до 5. После того, как BEM полностью пропитан в среде, от проксимальных или дистальных эпифизу, проколоть иглу в медуллярной полости BEM и вводить os клетки в BEM.
Инкубировать модель OS-BEM в течение как минимум двух часов в увлажненной атмосфере 5%углекислого газа при 37 градусах по Цельсию, чтобы обеспечить твердое присоединение инъекционных клеток к BEM. Затем вынул тарелку из инкубатора. Добавьте одну миллилитровую культурную среду на тарелку и держите ее в инкубаторе на ночь, чтобы полностью покрыть поверхность культуры BEM.
Аккуратно перенесите модель OS-BEM в новый колодец из шести хорошо пластины со стерильным пинцетом, и перекормить один миллилитр свежей среды культуры. Культура модели в течение 14 дней в инкубаторе. Во время 14-дневной инкубации продолжайте мониторинг среднего цвета.
Если среда превращается в оранжевый, или даже желтый, немедленно обновить среду, отбрасывая половину старой среды и добавить в новую среду для поддержания здоровой окружающей среды для клеток ОС. Держите мониторинг состояния клеток под перевернутым флуоресцентным микроскопом. Когда ячейки ОС расширяются до пластины, аккуратно перенесите модель OS-BEM в другую новую колодец со стерильными пинцетами.
После 14-дневной культуры, аккуратно промойте модель OS-BEM с PBS, чтобы удалить культурную среду. Затем перенесите в 15-миллилитровую центрифугу и добавьте 10%buffered формалин, чтобы исправить для гистологической идентификации. После деминерализации и децеллюляризации, BEM, как представляется, полупрозрачный с более сильной устойчивостью и упорством по сравнению с родной кости мыши.
Небольшой остаток мышц в пространстве медуллярной полости можно четко наблюдать. Яркие полевые изображения родной кости и децеллюляризованного BEM, показывают тщательное удаление ядер клеток. Естественная пористая структура в расположении сети коллагена хорошо поддерживается в децеллюляризованном BEM.
Кроме того, иммуногистохимическое окрашивание коллагена I и коллагена IV показывает, что основные компоненты внеклеточной матрицы сохраняются в голени мыши после децеллюляризации. Во время 14-дневной культуры, как periosteum, так и эндостеум проникают в результате расширения ячеек ОС. Клетки ОС на децеллюляризованном BEM показывают высокооднородную морфологию, похожую на цитопатических особенностей раздела ОС.
Иммуногистохимический анализ после культивирования в модели BEM в течение 14 дней показывает большие преимущества в долгосрочных культурах. Кроме того, OS клетки и BEM культуры, высоко выразить костной матрицы гликопротеина, который является специфическим для остеоидной матрицы. Эта трехмерная модель in vitro была использована для демонстрации фенотипической неоднородности и регулятивного механизма дедифференцирования остеосаркомы с успехом.
