Наш метод имеет важное значение, поскольку он позволяет исследователям изолировать и манипулировать различными типами клеток для исследования их индивидуального вклада линии в форму и функцию тканей. Этот метод является щадящей и эффективным методом разделения типов клеток и, как следствие, целостность клеток сохраняется для 3D культуры. Этот метод также может быть применен к другим системам, чтобы изолировать клетки, которые не имеют хорошо охарактеризованных биомаркеров.
Чтобы собрать две, три, четыре и пять молочных желез от 10 до 14 недель самки мыши, сначала сделайте один сантиметровый разрез в средней линии между двумя задними конечностями. Расширьте разрез до шеи и сделайте небольшие боковое разрезы от разреза средней линии к конечностям. Затем растянуть кожу учил, прежде чем обеспечить его с булавкой на каждой стороне животного.
Используя типсы, соберите лимфатические узлы из числа четырех желез. Чтобы удалить молочные железы, используйте острые ножницы, чтобы сократить под каждой области ткани, размещение тканей в 50 миллилитров четырех градусов по Цельсию DMEM-F12 дополняется 5%FBS и антибиотик-антимикотических, как они собирают. Когда все ткани были собраны, нарезать железы, пока куски могут поместиться легко через один миллилитр пипетки кончик вращающейся пластины по мере необходимости, так что все ткани фарш равномерно.
Затем перенесите фрагменты в три миллилитров среды пищеварения в один колодец из шести хорошо низкой адгезии блюдо в течение 14 часов при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. На следующее утро, осторожно пипетки тканей 10 раз с одним миллилитров микропайпера и передачи фрагментов ткани в 15 миллилитров трубки. Соберите ткань путем центрифугации и повторно посасыть гранулы в пять миллилитров свежего DPBS.
Фильтр подвески через предварительно мокрый 70 микрометровый нейлоновый ситечко клетки, полоскания трубки в ситечко четыре раза с 10 миллилитров 37 градусов по Цельсию DMEM-F12 за стирку. Чтобы освободить фрагменты тканей, удерживайте вкладку ситечком в перчатках пальцами и инвертировать ситечко над 60-миллиметровой тканью культуры блюдо. Пройдите четыре миллилитровых алицита поддержания среды через дно ситечко и быстро изучите блюдо на одиночные клетки, жировые капли и загрязняющие ткани под перевернутым микроскопом.
Затем поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 24 часов, чтобы фрагменты тканей прилипли к блюду и для создания двуслойных фрагментов. Чтобы отделить миоэпителиальные клетки от светящихся эпителиальных клеток, промойте блюдо одним миллилитром DPBS, прежде чем добавить в клетки один миллилитр свежего 0,5%трипсина-ЭДТА. Тщательно следите за пищеварением под перевернутым микроскопом.
Внешний слой миепителиальных клеток начнет отделяться в течение трех-шести минут. Когда миепителиальные клетки отсоединились, перенесите супернатант в 15 миллилитровую трубку, содержащую два миллилитров 10%FBS в DPBS. Не нарушая светящиеся эпителиальные клетки, аккуратно промойте блюдо двумя миллилитров DPBS, прежде чем добавить свежий миллилитр трипсина-ЭДТА в оставшиеся клетки.
Через семь-пятнадцать минут, утолить энзиматической реакции с двумя миллилитров 10%FBS в PBS и передать клетки в новую 15 миллилитровую трубку. Очень важно внимательно следить за клетками во время дифференциальной трипсинизации и не переваривать клетки. Когда обе фракции были собраны, центрифуза клеток, чтобы удалить любые остаточные реагент диссоциации и повторно гранулы в 250 микролитров обслуживания среды на трубку.
После подсчета, разбавить каждую популяцию клеток в 1,2 раза от 10 до четырех клеток на концентрацию хорошо в свежей среде обслуживания. Добавьте 90 микролитров 50%внеклеточной матрицы в DMEM-F12 без фенола красного цвета к каждому колодец восьми-хорошо камеры слайда. Когда все скважины будут покрыты, затвердеть базовый слой в инкубаторе клеточной культуры в течение 30 минут.
Во время этой полимеризации, собирать фракции клеток путем центрифугации и повторного перерасхода каждой популяции в 100 микролитров 10%extracellular матрицы в 90%рост среды на колодец. Затем добавьте 100 микролитров каждой клеточной подвески к каждому колодец и позвольте со-культурам поселиться в течение 20 минут в инкубаторе клеточной культуры. В конце инкубации аккуратно добавьте 100 микролитров среды роста вниз по стороне каждой камерной стенки и верните слайд в инкубатор клеточной культуры.
Изображение клеток каждые 24 часа, чтобы отслеживать их рост и мягко обновить рост среды каждые два-три дня. Чтобы исправить органоиды для иммуностимулирования, в соответствующей экспериментальной точке времени, тщательно аспирировать среды от каждого слайда, чтобы быть изображены и промыть каждый колодец с 200 микролитров DPBS на колодец. Исправить органоиды с 200 микролитров 4 градусов по Цельсию параформальдегид в течение 10 минут при комнатной температуре перед лечением органоидов с 200 микролитров 0,2% глицина в DPBS на колодец в течение 30 минут при комнатной температуре.
В конце инкубации, пронизывают органоиды с 0,25%triton X-100 в DPBS в течение 10 минут при комнатной температуре с последующим блокированием неспецифической привязки с 5%donkey сыворотки или соответствующей сыворотки, которая соответствует видов вторичного антитела в DPBS в течение одного часа с качания. Затем этикетка клеток с 125 до 200 микролитров соответствующих первичных антител, представляющих интерес в 1%donkey сыворотки в DPBS ночь на четыре градуса по Цельсию с качания. На следующее утро, мыть каждый хорошо два раза с 200 микролитров DPBS плюс тритон X-100 до маркировки органоидов с соответствующим флуоресценции конъюгированных вторичных антител в течение 45 минут при комнатной температуре с качания защищены от света.
Затем мыть каждый хорошо два раза со свежим DPBS плюс тритон X-100, как попродемонстрировано, и изображение органоидов с помощью флуоресцентной микроскопии в соответствии со стандартными протоколами. После 24 часов инкубации очищенные эпителиальные фрагменты прилипли к нижней части культурного блюда, образуя плоские блинные структуры с внешним слоем миоэпителиальных клеток, окружающих внутренний слой светящихся эпителиальных клеток. Трипсин лечение дифференциально отделяет клетки с миоэпителиальных клеток отсоединения первой и появляются как яркие округлые клетки, которые окружают ядро оставшихся кубоидных светящихся эпителиальных клеток.
Общая чистота двух клеточных отсеков составляет около 90%, как оценивается выражением кератина-14 и Е-кадерин в двух популяциях. После 10 дней культуры в 10%внеклеточной матрице на 50%внеклеточной матричной основе, как было продемонстрировано, миоэпителиальные светящиеся эпителиальные органоиды клеток образуют большие разветвленные структуры с хорошо развитыми люменами. Дифференциация на пятый день с добавлением альвеологенез среды вызывает образование больших, более разветвленных молокосодержащих органоидов.
Важно помнить, чтобы тщательно мыть ситечко при сборе эпителия, чтобы убедиться, что Есть нет стромальных загрязняющих веществ. Чтобы запросить изменения в экспрессии генов, исследователи могут собирать РНК из органоидов, выпуская их из внеклеточной матрицы с помощью восстановительного раствора. Параформальдегид считается опасным, и исследователи должны использовать средства индивидуальной защиты и работать внутри дымового капота при использовании этого реагента.
