Наш протокол предоставляет ученому мощный инструмент для объединения нескольких микропараметров на уровне одной клетки от IPS человека и их нейро- и прозрачных производных. Эти протоколы позволяют веселить митохондриальные параметры, как на общем уровне, так и на конкретном уровне на митохондриальный объем, используя проточную цитометрию. Этот метод может быть применен к нескольким типам клеток, в том числе от других нейродегенеративных заболеваний.
Таким образом, это может помочь дать представление о механизмах, лежащих в основе этих типов заболеваний, а также потенциально помочь в терапевтическом скрининге. Для начала посейте клетки отдельно в четыре лунки в шестилуночной пластине и инкубируйте клетки до тех пор, пока не будет достигнуто от 50 до 60% конфлюзии. В конце периода культивирования готовят пять отдельных окрашивающих растворов, содержащих различные комбинации питательной среды, FCCP, TMRE, MTG и mito sock spread.
Добавьте их в соответствующие колодцы и инкубируйте клетки, как описано в рукописи. Далее аспирировать среду из всех колодцев и промыть PBS. Для отслоения клеток инкубируют клетки с помощью одного миллилитра реагента диссоциации клеток при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Нейтрализуют клеточный диссоциационный реагент одним миллилитом ДМЭМ, дополненным 10% FBS. Затем соберите содержимое лунки в 15-миллилитровую летопись. Гранулируйте ячейки путем центрификации и промывайте гранулу ячейки PBS один или два раза.
Аспирируйте весь супернатант, оставляя примерно 100 микролитров в трубке. Повторно суспендируйте гранулы клеток в 300 микролитрах PBS. После переноса клеточной суспензии в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку держите трубку в темноте при комнатной температуре.
Проанализируйте клетки с помощью проточного цитометра с настройками полосового фильтра, описанными в текстовой рукописи. Отделите около 1 миллиона клеток с помощью реагента диссоциации клеток и гранулируйте клетки, как было продемонстрировано ранее. Нейтрализуйте клеточную суспензию с помощью DMEM плюс 10% FBS и соберите суспензию в 15-миллилитровую трубку.
Зафиксируйте клетки одним миллилитом 1,6% параформальдегида при комнатной температуре в течение 10 минут. Пермеаболизируют клетки одним миллилитром ледяного холодного 90%метанола при минус 20 градусах Цельсия в течение 20 минут. Затем блокируйте образцы в одном миллилитре блокирующего буфера и промывайте клетки центрифугированием PBS, как показано на рисунке.
Для обнаружения различных митохондриальных комплексов и субъединиц инкубируют клетки в течение 30 минут с соответствующими первичными антителами, описанными в текстовой рукописи. После однократного промывания клеток PBS инкубируют клетки с вторичным антителом в течение 30 минут. В конце инкубации промывайте и повторно приостанавливайте клетки и PBS, как показано на рисунке.
Переложите клеточную суспензию в 1,5-миллилитрную микроцентрифужную трубку, хранящуюся в темноте на льду. Затем проанализируйте клетки на проточном цитометре и определите сигналы и отфильтруйте один с помощью 5-полосового фильтра 30/30. Для каждой подпопуляции клеток выберите график гистограммы и проанализируйте среднюю интенсивность флуоресценции или MFI различных каналов фильтра.
Рассчитайте уровни TMRE, конкретные значения для комплексной субъединицы MMP ROS и TFAM, как описано в тексте рукописи. Проточная цитометрия и живые клетки использовались для исследования митохондриального объема MMP и уровней АФК. В нейронах POLG DA наблюдалось более низкое специфическое MMP и более высокое специфическое ROS, при этом не наблюдалось изменений в объеме митохондрий, общем MMP и ROS.
Астроциты POLG имели снижение MMP, но не изменение объема митохондрий и АФК. Проточная цитометрия и фиксированные клетки были использованы для исследования уровня субъединицы комплекса MRC и TFAM. Нейроны DA показали увеличение сложного первого и TFAM по сравнению с контролем, но не изменили сложный двухуровневый.
Астроциты POLG показали снижение комплекса один четыре и специфический TFAM. Поскольку плотность клеток также может влиять на MMP и взаимосвязь между ФЛУОресценцией MTG и MMP, это специфично для клетки. Адаптация этого протокола к другим типам клеток, вероятно, потребует оптимизации После этой процедуры может быть выполнена микроскопическая асис, например, конфокальная микроскопия, предоставляющая дополнительные сведения о митохондриальных структурах.
Таким образом, хотя эта стратегия обнаруживает митохондриальную дисфункцию в нейронах DA и астроцитах от известного митохондриального заболевания, эти методы также могут быть применены для изучения функции митохондрий в любом типе клеток и заболеваний.
