Митохондриальная функция имеет решающее значение для гематопоэтического обновления стволовых клеток. Митохондриальная активность является отражателем внутреннего митохондриального мембранного потенциала, который может быть измерен TMRM, клеточным флуоресцентным, клеточным катионическим красителем. Ксенобиотические насосы эффлюкса очень активны в HSC, и вызывают экструзию TMRM.
Основным преимуществом этого протокола является коррекция этого эффекта, используя Verapamil, ингибитор насосов эффлюкса. Начните с изоляции костного мозга от бедренной кости мыши. Используйте пару типсов и острые ножницы, чтобы сократить две задние лапы.
Затем сделайте небольшой фрагмент в брюшной коже мыши, и растянуть его. Извлекайте бедренную кость и голени, при этом заботясь, чтобы не выбить головы бедренной кости, и поместите кости в шести-хорошо пластины, наполненные 1,5 миллилитров окрашивания буфера. Удалить мышцы из костей, и сократить концы костей, что позволяет костного мозга, чтобы выйти.
Поместите очищенные кости в новые колодцы, с 1,5 миллилитров окрашивания буфера. Затем вымоййте костный мозг с помощью трехмилилитрового шприца и иглы 25 калибра, пока кость не станет белой. Соберите все клетки в 1,5 миллилитровую трубку, и центрифуга их в течение пяти минут при 180 раз G, а затем отказаться от супернатанта.
Тщательно повторно помесить гранулы в 300 микролитров ледяной ACK лизай буфера, и положить клетки на лед в течение одной минуты. Затем немедленно деактивировать лиз, добавив один миллилитр окрашивания буфера. Центрифуга клеток в течение пяти минут в 180 раз G.Resuspend ячейки гранулы, которые должны появиться белые, в один миллилитр окрашивания буфера.
Фильтр клетки с помощью крышки ситечко клетки, с 35 микрометровой нейлоновой сеткой, чтобы получить моноядерные клетки. Начните с подготовки линии коктейль, и флюорофор конъюгированных антител, в соответствии с рукописными указаниями. Держите антитела на льду, и защищены от света.
Затем центрифуга образец в течение пяти минут при 180 раз G, и отказаться от супернатанта. Добавьте 400 микролитров коктейля линии и четыре микролитера биотинилированных антител CD135 в клеточные гранулы и вихревые смеси. Затем инкубировать его на льду в течение 30 минут.
После инкубации, мыть образец, добавив три миллилитров окрашивания буфера, спиннинг его вниз в течение пяти минут при 180 раз G, и отбрасывая супернатант. Затем добавьте 400 микролитров раствора антител и вихрем смеси. Инкубировать его на льду еще 30 минут, и повторить мыть с окрашивания буфера.
Для приготовления раствора окрашивания ТМРМ добавьте 2,2 микролитера раствора TMRM и 1,1 микролитров Verapamil к 1,1 миллилитров безотхвисточной гематопоэтической культуры среднего, с тромбопоэтиным и стволовым клеточным фактором. Переподходить костный мозг в один миллилитр раствора окрашивания TMRM, вихрь быстро, и инкубировать в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию. Фильтр образца с помощью крышки ситечко клетки, с 35 микрометровой нейлоновой сеткой, чтобы избежать засорения цитометра потока.
Затем добавьте один микролитер DAPI и приступайте к цитометрии потока. Вы запустите образец костного мозга, и приобрести по крайней мере один миллион событий. Затем отобразите живые моноядерные клетки костного мозга в участке для тихоокеанского синего цвета, чтобы определить CD135 Lin-отрицательные и лин-положительные фракции.
Участок Lin-отрицательная фракция для APC/Cy7 против PE/Cy7 для определения мультипотентного прародителя или фракции MPP. Затем вырисуй фракцию MPP для APC против PerCP/Cy5.5, чтобы определить гематопоэтическую стволовую клетку или фракцию HSC. Отображение фракции HSC для FITC, или CD34, чтобы разделить ее на CD34 отрицательных HSC и CD34 положительных фракций HSC.
Окончательно приобретайте интенсивность TMRM в каждой населенности. Чтобы Окрашивание ТМР работало правильно, добавьте в образец один микролитр FCCP для окончательной концентрации одного миллимолара и инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Затем приобрети миллион событий.
После добавления FCCP интенсивность ТМРМ должна быть резко увеличена. Этот протокол был успешно использован для количественной оценки митохондриального мембранного потенциала в различных популяциях клеток, с красителем TMRM. Было продемонстрировано, что присутствие PBS и FBS в культурной среде влияет на интенсивность сигнала TMRM.
Поэтому важно выполнять Окрашивание TMRM в среде расширения без сыворотки. Гематопоэтические стволовые клетки выражают высокий уровень активности ксенобиотических насосов эффлюкса, которые выдавляют краситель TMRM. Профили TMRM также различаются в присутствии Verapamil или Cyclosporin H, которые блокируют насосы.
Чтобы проверить точность окрашивания TMRM, FCCP может быть деполяризировать митохондрии, и уменьшить интенсивность TMRM. Этот протокол может быть легко адаптирован для изучения HSC с различными митохондриальной мембраны потенциального красителя, в том числе TMRE или JC-1. А также другие митохондриальные красители, такие как MitoTracker или MitoSOX.
Критические вопросы, унаследованные различной активностью эффлюкс насосов среди популяции костного мозга было отмечено совсем недавно. Таким образом, этот протокол направлен на сокращение расхождения между предыдущими выводами.
