Наша культурная система фиксирует фенотипической пластичности клеток плоскоклеточной карциномы легких в ответ на опухолевых взаимодействий стромы и как эти взаимодействия регулируют морфологию опухоли во время прогрессирования плоскоклеточной карциномы легких. Основным преимуществом нашей системы является ее способность моделировать биологию плоскоклеточных клеток легких в 3D-контексте, сохраняя при этом пластичность злокачественных клеток. Эта 3D кокультура обеспечивает уникальную систему для исследования опухолевых взаимодействий клеток стромы и может быть адаптирована для мониторинга реакций клеток карциномы плоскоклеточных легких и связанных с раком фибробластов для лечения наркомании.
Для начала оттаивать флаконы мембранной матрицы подвала в четырехградсовом холодильнике по Цельсию на ночь. Охладить двухми миллилитров пластиковые пипетки и советы при температуре минус 20 градусов по Цельсию на ночь. На следующий день, тепло реагентов, используемых для разобщения TUM622 клеток, HEPES буфер, трипсин / ЭДТА, и трипсин нейтрализации буфера в 37-градусной по Цельсию водяной бане.
Вывихнул из холодильника оттаявую мембранную матрицу подвала и положите флакон на лед. Охладить пластины культуры тканей на металлической платформе кулер размещены на льду. Поместите центрифуговые трубки на металлическую стойку охлаждения на льду.
Рассчитайте количество необходимых клеток на основе количества скважин и концентрации клеток в каждой скважине, чтобы быть готовым. Передача TUM622 клеточной подвески в охлаждено центрифугу трубки и спина вниз на 300 раз г в висит ведро центрифуги при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. С аспирирующим пипеткой, прикрепленной к нефильтрованной наконечнику, аспирировать супернатант тщательно, оставляя около 200 микролитров среды в трубке.
Аккуратно нажмите на стороне трубки, чтобы выбить и разобщить гранулы, а затем вернуть его в стойку охлаждения. Используя двухми миллилитровые предварительно обмазаемые пипетки, аккуратно смешайте матрицу на льду, трубя вверх и вниз несколько раз. Pipette на равномерной и умеренной скорости, так что никаких пузырьков вводятся в матрицу во время этой процедуры.
Перенесите 1,1 миллилитров матрицы в каждую центрифугу. Используя предварительно облеарелые кончики, пипетка матрицы в каждой трубке вверх и вниз около 10 раз, чтобы сделать равномерной подвески клеток. Перенесите 310 микролитров клеточной матричной подвески в каждую колодец предварительно заправленной 24-хорошой пластины.
Поместите пипетки под углом 90 градусов к поверхности пластины и добавьте подвеску к центру колодец. Подвеска распространяется и охватывает всю колодец. Для облегчения анализа иммунофлуоресценции ниже по течению перенесите 60 микролитров клеточной матричной подвески в хорошо центр двухколодецовой камерной горки.
Это позволяет матрице образовывать куполообразную конструкцию с гораздо меньшим объемом. Верните пластину и камеру слайд обратно в инкубатор культуры тканей и инкубировать в течение 30 минут, чтобы матрица затвердеть. После этого изучите пластину и сдвиньте под световым микроскопом, чтобы гарантировать равномерное равномерное равномерное распределение одиночных ячеек в матрице.
Добавьте один миллилитр предварительно разогретой 3D-культуры в каждый колодец пластины и 1,5 миллилитров 3D-культуры в каждый колодец камерного слайда, а затем верните их в инкубатор. После подготовки клеточных суспензий TUM622 и CAFs, как описано ранее, подсчитайте плотность клеток CAF, смешивая 10 микролитров клеточной подвески с 10 микролитров трипан-синего цвета. Добавьте 10 микролитров смеси к каждой из двух камер на гемоцитометре, чтобы подсчитать и рассчитать плотность клеток.
Для совместного встраивания клеток TUM622 и CAFs в мембранную матрицу подвала сначала вычислите нужное количество клеток, используемых для покрытия на основе информации о плотности клеток. CAFs посеяны в соотношении 2:1 клеток TUM622. Перенесите расчетный объем TUM622s, а также подвеску ячейки CAF в ту же трубку центрифуги.
Спин вниз и аспирировать все среды. Resuspend в матрице мембраны подвала и плите 310 микролитров смеси в каждый колодец плиты 24-хорошо. Для иммунофторесценции перенесите 60 микролитров смесей TUM622 и CAF на камерные слайды, как описано ранее.
Для совместной культуры TUM622 с наложенными CAFs в мембранной матрице подвала, сначала создали монокультуру TUM622, как описано ранее, передача в два раза больше подвески CAF в центрифугу трубки, и спина вниз в 300 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант и повторно избавлять CAFs в среде культуры, передавать в два раза больше клеток CAF, которые были повторно использованы в среде культуры в каждой из скважин, содержащих встроенные клетки TUM622. Типичные клетки TUM622 в 2D культуре округляются большими ядрами, в то время как CAFs плоские и удлиненные.
Посеянные в 3D-культуре, одиночные клетки TUM622 были способны формировать органоиды с ацинароподобными морфологиями при встроении. Между днями 5 и 7, lumen стало явно в acinarlike структурах и остало полым в дальнейшем. Каждый ацинус, состоящий из монослой клеток, окружающих полый люмен, отображается надлежащей апиальной базальной полярности похож на эпителия легких in vivo.
Эти ацинарные структуры были гиперпластичными и продолжали расти до 24 дней, прежде чем внеклеточная матрица полностью распалась. В кокультурах TUM622-CAF, либо наложения или совместного встраивания, наличие CAFs значительно увеличило количество и размер сфероидов формируется. Интересно, что, когда TUM622 acini вошел в непосредственной близости с CAFs, они побудили acini стать инвазивными и мигрировать в сторону CAFs, образуя слезы, как структуры.
Для обеспечения надежного образования ацинароподобных структур крайне важно поддерживать матрицу мембраны подвала в жидком виде в течение всего процесса встраивания клеток. Органоиды TUM622 могут быть использованы для различных анализов вниз по течению, включая, но не ограничиваясь иммунофлуоресцентной, иммуногистохимией, цитометрией потока, РНК и извлечением белка, а также могут быть модифицированы для скрининга лекарств. Используя эту систему в качестве платформы, можно исследовать, как опухолевые клетки внутренние, а также клеточные внешние изменения в микрооквидеоронации опухоли может повлиять на эпителиальной архитектуры опухоли и образования карциномы.
