Этот протокол полезен для характеристики монтажных функций бактериальных секреции комплексов и может привести к фундаментальному пониманию молекулярных механизмов, необходимых для взаимодействия патогенов-хозяина. Этот метод интегрирует дополнительные подходы, которые сохраняют родную структуру образца и позволяют и видят визуализацию белковых комплексов в нетронутых бактериальных клетках. Это увеличивает наше понимание структурных функциональных отношений бактериальных систем секреции.
Этот метод может быть адаптирован для изучения других типов систем секреции или других клеточных комплексов в широком спектре бактериальных видов. Начните с создания агарозы колодки для живой визуализации клеток. Подготовка около 30 мл 1%низкого раствора расплава агарозы в воде и микроволновой печи его в стеклянной колбе в течение примерно 90 секунд закрученного его время от времени, пока агароза полностью растворяется.
Поместите два 22 на 22 на 0,15 мм стеклянные слайды на краю 25 на 75 на 1,1 мм стеклянный слайд один поверх другого. Затем сложите еще два небольших слайда на другом краю. Pipette около 1 мл расплавленной агарозы в центре слайда между двумя верхними стеклянными горками и место другой большой слайд на вершине расплавленной агарозы убедившись, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
Охладить слайды при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут, а затем использовать скальпель или лезвие бритвы, чтобы аккуратно разрезать площадку на небольшие квадратики. Зафиксирует двустороннюю клеевую раму на стеклянной горке 25 на 75 на 1,1 мм и поместите несколько колодок на горку. Растворите тяжелый участок Legionella Pneumophila в 1 мл двойной дистиллированной воды.
Затем вихрь и пипетка два-три микролитера разбавления на прокладки. Аккуратно поместите крышку 58 на 24 на 0,15 мм над клейкой рамой. Выберите ячейки для визуализации с помощью яркого освещения поля.
Затем, в окне захвата программного обеспечения микроскопа, отрегулируйте ND до 180 и биннинг на два на два. Используйте 488 нанометровый канал, чтобы выставить образец на 500-1000 миллисекунд и проверить специфичность флуоресценции с помощью изображений нетеговых Legionella Pneumophila с теми же параметрами. Чтобы количественно оценить полярность, отрегулируйте контраст изображения, чтобы бактерии были хорошо видны.
Затем увеличьте область интереса и используйте инструмент региона, чтобы поместить прямоугольник 0,25 на 1,3 микрометра, начиная с полюса и расширяясь в цитоплазму, убедившись, что прямоугольник остается в пределах бактериальных границ. Отметь не менее 200 бактерий и создайте маски, используя область для маскировки кнопки в меню анализа. Нажмите на статистику масок и выберите объект под маской.
Затем отметут среднее интенсивность и дисперсию по характеристикам и интенсивности. Экспорт данных в качестве текстового файла и использование приложения электронной таблицы для расчета полярности оценки каждой бактерии, как соотношение между дисперсией и среднего интенсивности. Для высокой пропускной способности приложения используют микроскопию контрастности лица для получения изображений двойного канала.
Убедитесь в том, чтобы выбрать поля зрения, где бактерии полностью разделены. Затем отрегулируйте контраст лица канала изображения до уровня, при котором бактерии хорошо видны. Откройте двойное изображение канала и запустите окно маски сегмента.
Отрегулируйте соответствующий порог, затем удалите небольшие объекты, нажав кнопку определения объектов и отрегулируя минимальный размер до 100 пикселей. Под маской уточнить, выберите удалить края объектов и отдельных масок бактерий, которые примыкают друг к другу. Для количественной оценки динамики белков синтеза откройте окно захвата изображения и отметь промежуток времени.
Введите два в поле времени точек. Приобрети два успешных изображения Legionella Pneumophila, выражающ флуоресцентный белок интереса. Отрегулируйте контраст изображения до тех пор, пока ячейки не будут хорошо видны.
Затем используйте инструмент региона, чтобы поместить квадрат 0,25 на 0,25 микрометра в середине не менее 400 ячеек. Далее используйте область, чтобы замаскировать кнопку в меню анализа, чтобы создать маску квадратов интереса. Создайте новую пустую маску и используйте пиксельный инструмент, чтобы отметить всю область ячейки, по крайней мере 25 случайных ячеек.
Создайте другую маску и используйте большой инструмент кисти, чтобы отметить области между ячейками. Наконец, выберите статистику масок и убедитесь, что объект выбран под маской для маски один. По функциям и интенсивности выбирайте средняя интенсивность.
Экспортировать данные и повторить процесс для маски 2. Для маски 3, выберите всю маску и экспортировать средняя интенсивность. Чтобы подготовить образец криотомографии электрона, вырастить тяжелый участок Legionella Pneumophila на пластинах CYE Agrastreptomisum в течение 48 часов при 37 градусах по Цельсию.
Переусердовать клетки в воде до OD 600 около 0,7. Затем добавьте пять микролитров коллоидных частиц золота в 20 микролитров клеточной суспензии. Свечение разряда дырявой углеродной сетки и пипетки пять микролитров клеточной смеси на нем.
Пусть это стоять в течение одной минуты. Пятно сетки с фильтровальной бумагой и заморозить его в жидком этан с помощью гравитационного аппарата поршень. После вставки суперфолдер GFP в хромосому Legionella Pneumophila, живая флуоресцентная микроскопия клетки была выполнена для сравнения флуоресцентного сигнала с родительским суперфолдерным отрицательным штаммом GFP.
Кроме того, для изучения доли клеток с определенным флуоресцентным сигналом использовалась яркая полевая микроскопия. Лишь часть клеток, которые произвели DotB суперфолдер GFP отображается поляризация синтеза белка. При характеристике распределения флуоресцентного сигнала DotB было установлено, что интенсивность суперфольбера DotB GFP на полюсах была примерно в два раза выше, чем в цитозоле.
Для исследования того, зависела ли полярная локализация DotB superfolder GFP от полностью собранной системы секреции типа 4, для отдельных клеток в диком типе и в мутанте системы секреции типа четыре были определены полярные баллы суперфолдерного GFP DotB. Действительно, полярное позиционирование суперфолькера DotB GFP исчезло, когда система Dot/ICM была удалена. Динамические модели показали, что DotB ATPase присутствует в динамической цитозолической популяции и был завербован в полярную локализованную систему секреции типа Dot/ICM на поздней стадии сборки.
Высокая пропускная способность крио-ET была использована для визуализации нетронутой типа четыре аппарата системы секреции в штамме Legionella Pneumophila, выражающего сверхтябрящий GFP DotB. Реконструкция ячейки выявила несколько машин Dot/ICM, встроенных в оболочку ячейки. Было также определено общее позиционирование DotB и суперфолдерного GFP по отношению к нетронутой машине системы секреции типа 4.
Трехмерные визуализации поверхности показали, что сверхтябрь GFP расположен ниже гексамера DotB, который собирается в качестве диска у основания цитоплазмического комплекса ATPase. При попытке этого метода, убедитесь, что для оценки стабильности синтеза белков и функциональность системы секреции тегов, прежде чем приступить к изображению приобретения. Моделирование и примерка могут быть эффективными способами анализа динамических моделей и структурной плотности, а также для оценки конформациальных изменений или локализации подразделений в структуру.
Такой подход может помочь понять, как функционируют секретные компоненты секретной системы типа четыре, как они взаимодействуют в рамках более сложного комплекса и какие функции выполняют различные подсемейные работы.
