هذا البروتوكول مفيد لتميز وظائف تجميع مجمعات إفراز البكتيريا ويمكن أن يؤدي إلى فهم أساسي للآليات الجزيئية المطلوبة للتفاعلات المسببة للأمراض المضيفة. هذه التقنية يدمج النهج التكميلية التي تحافظ على الهيكل الأصلي للعينة ويسمح وانظر إلى تصور مجمعات البروتينات في الخلايا البكتيرية سليمة. يزيد من فهمنا للعلاقات وظيفة الهيكلية من نظم إفراز البكتيريا.
يمكن تكييف هذه الطريقة لدراسة أنواع أخرى من أنظمة إفراز أو غيرها من المجمعات الخلوية في مجموعة واسعة من الأنواع البكتيرية. ابدأ بصنع منصات agarose لتصوير الخلايا الحية. إعداد حوالي 30 مل من 1٪ منخفضة تذوب حل agarose في الماء والميكروويف في قارورة زجاجية لمدة 90 ثانية تدور في بعض الأحيان حتى يتم حل agarose تماما.
ضع اثنين من 22 في 22 من قبل 0.15mm الشرائح الزجاجية على حافة 25 من قبل 75 من قبل 1.1mm الزجاج الشريحة واحد على رأس الآخر. ثم قم بتكديس اثنين من الشرائح الأصغر على الحافة الأخرى. الماصات حوالي 1 مل من agarose المنصهر في الشريحة وسط بين الشرائح الزجاج العلوي اثنين ووضع شريحة كبيرة أخرى على رأس agarose المنصهر التأكد من تجنب تشكيل فقاعات الهواء.
تبرد الشرائح عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة ثم استخدم مشرط أو شفرة حلاقة لقطع الوسادة بلطف إلى مربعات صغيرة. إصلاح إطار لاصق على الوجهين على شريحة زجاجية 25 في 75 في 1.1 مم ووضع عدة منصات على الشريحة. حل رقعة ثقيلة من الفيلق Pneumophila في 1 مل من الماء المقطر المزدوج.
ثم دوامة وماصات اثنين إلى ثلاثة ميكرولترات من التخفيف على منصات. ضع غطاءً برفق 58 في 24 في 0.15 مم على الإطار اللاصق. حدد الخلايا للتصوير باستخدام إضاءة المجال الساطعة.
ثم، في نافذة التقاط برنامج المجهر، ضبط ND إلى 180 وbinning إلى اثنين من قبل اثنين. استخدم قناة نانومتر 488 لفضح العينة لمدة 500 إلى 1000 مللي ثانية والتحقق من خصوصية الفلورسينس عن طريق تصوير الفيلقية غير الموسومة Pneumophila بنفس المعلمات. لتحديد القطبية، ضبط النقيض من الصورة حتى تكون البكتيريا مرئية بوضوح.
ثم التكبير في المنطقة من الفائدة واستخدام أداة المنطقة لوضع مستطيل 0.25 من 1.3 ميكرومتر بدءا من القطب وتمتد إلى السيتوبلازم مع التأكد من أن المستطيل يبقى داخل الحدود البكتيرية. ضع علامة على 200 بكتيريا على الأقل وإنشاء أقنعة باستخدام المنطقة لإخفاء الزر في قائمة التحليل. انقر على الإحصاءات قناع واختيار الكائن تحت نطاق قناع.
ثم قم بوضع علامة على شدة الوسط والتباين ضمن الميزات والكثافة. تصدير البيانات كملف نصي واستخدام تطبيق جدول البيانات لحساب درجات قطبية كل بكتيريا كنسبة بين التباين وكثافة المتوسط. بالنسبة للتطبيقات عالية الإنتاجية استخدام المجهر التباين الوجه للحصول على صور قناة مزدوجة.
تأكد من اختيار مجالات الرؤية حيث يتم فصل البكتيريا بشكل كامل. بعد ذلك، ضبط تباين قناة الوجه للصورة إلى مستوى حيث تكون البكتيريا واضحة للعيان. افتح صورة القناة المزدوجة وافتح نافذة قناع القطعة.
اضبط العتبة المناسبة، ثم قم بإزالة الكائنات الصغيرة بالنقر فوق الزر تعريف الكائنات وضبط الحد الأدنى للحجم إلى 100 بكسل. تحت قناع تنقية، حدد إزالة الكائنات حواف وأقنعة منفصلة من البكتيريا التي هي المتاخمة لبعضها البعض. لتحديد ديناميات البروتينات الانصهار، وفتح نافذة التقاط الصورة ووضع علامة على الفاصل الزمني.
أدخل اثنين في عدد من نقاط الوقت مربع. الحصول على صورتين ناجحتين من الفيلق Pneumophila التعبير عن البروتين الفلورسنت من الفائدة. ضبط تباين الصورة حتى تظهر الخلايا بوضوح.
ثم استخدم أداة المنطقة لوضع مربع 0.25 في 0.25 ميكرومتر في منتصف 400 خلية على الأقل. بعد ذلك، استخدم المنطقة لزر قناع في القائمة تحليل لإنشاء قناع من مربعات الفائدة. إنشاء قناع فارغ جديد واستخدام أداة بكسل لوضع علامة على منطقة الخلية بأكملها من 25 خلايا عشوائية على الأقل.
إنشاء قناع آخر واستخدام أداة فرشاة كبيرة لوضع علامة على المناطق بين الخلايا. وأخيراً، حدد إحصائيات قناع وتأكد من تحديد الكائن تحت نطاق قناع واحد. تحت الميزات وكثافة، واختيار كثافة متوسط.
تصدير البيانات وتكرار عملية قناع 2. بالنسبة إلى القناع 3، حدد القناع بالكامل ثم قم بتصدير شدة الوسط. لإعداد عينة التصوير المبرد الإلكترون، تنمو رقعة ثقيلة من الفيلق Pneumophila على لوحات CYE Agrastreptomisum لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية.
إعادة تعليق الخلايا في الماء إلى OD 600 من حوالي 0.7. ثم إضافة خمسة ميكرولترات من جزيئات الذهب الغروية إلى 20 ميكرولترات من تعليق الخلية. توهج تصريف شبكة الكربون حفرة وماصة خمسة ميكروليترس من خليط الخلية على ذلك.
دعه يقف لدقيقة واحدة لطخة الشبكة مع ورقة مرشح وتجميده في الإيثان السائل باستخدام جهاز المكبس الجاذبية التي تحركها. بعد إدخال superfolder GFP في كروموسوميوم الفيوريلا الفيلقية، تم إجراء المجهر الخلية الحية لمقارنة إشارة الفلورسنت مع تلك التي من سلالة الوالدين فائقة GFP السلبية.
وبالإضافة إلى ذلك، استخدم المجهر الميداني الساطع لفحص نسبة الخلايا التي تحتوي على إشارة فلورية محددة. فقط جزء صغير من الخلايا التي أنتجت DotB superfolder GFP عرض التعريب القطبي للبروتين الانصهار. عند توصيف توزيع إشارة الفلورسنت DotB ، وجد أن شدة المجلد الفائق من DotB في القطبين كانت أعلى مرتين من الدوسول.
للتحقيق في ما إذا كان DotB superfolder GFP القطبي المحلي يعتمد على نظام إفراز من النوع الرابع مجمع بالكامل ، تم تحديد درجات القطبية من DotB superfolder GFP للخلايا الفردية في نوع البرية ، وفي نظام إفراز من النوع أربعة متحولة. في الواقع ، اختفت المواقع القطبية من DotB superfolder GFP عندما تم حذف نظام Dot / ICM. أشارت الأنماط الديناميكية إلى أن DotB ATPase كان موجودًا في مجموعة cytosolic ديناميكية وتم توظيفه في نظام إفرازات من النوع الأربعة في مرحلة متأخرة من التفاعل.
تم استخدام عالية الإنتاجية cryo-ET لتصور نظام إفراز نوع أربعة سليمة في سلالة الفيلق Pneumophila التعبير عن DotB superfolder GFP. إعادة بناء الخلية كشفت العديد من آلات دوت / ICM جزءا لا يتجزأ من المغلف الخلية. كما تم تحديد الموقع العام لـ DotB وGFP فائقة المجلد فيما يتعلق بـ الجهاز نظام إفرازات من النوع الرابع.
وأشار الاداءات سطح ثلاثي الأبعاد أن يتم وضع GFP فائقة المجلدات تحت الهيكسمر DotB، الذي يتجمع كقرص في قاعدة مجمع ATPase cytoplasmic. عند محاولة هذه التقنية، تأكد من تقييم استقرار البروتينات الانصهار وظيفة نظام إفراز العلامة قبل الشروع في الحصول على صورة. يمكن أن يكون وضع النماذج والملاءمة من الطرق الفعالة لتحليل الأنماط الديناميكية والكثافة الهيكلية وكذلك لتقييم التغيرات التكونية أو تحديد موضع الوحدات الفرعية في الهيكل.
يمكن أن يساعد هذا النهج في فهم كيفية مختلف أنواع أربعة مكونات النظام السري وظيفة، وكيف تتفاعل داخل أكثر تعقيدا، وما هي وظائف subassemblies مختلفة تنفيذ.
