Bu protokol, bakteriyel salgı komplekslerinin montaj fonksiyonlarını karakterize etmek için yararlıdır ve konak patojen etkileşimleri için gerekli olan moleküler mekanizmaların temel bir şekilde anlaşılmasına yol açabilir. Bu teknik, numunenin doğal yapısını koruyan tamamlayıcı yaklaşımları entegre eder ve bozulmamış bakteri hücrelerindeki protein komplekslerinin görselleştirilmesine izin verir ve görselleştirmeyi sağlar. Bakteriyel salgı sistemlerinin yapısal fonksiyon ilişkilerini anlamamızı arttırır.
Bu yöntem, bakteri türlerinin geniş bir yelpazede salgı sistemleri veya diğer hücresel kompleksleri diğer türleri incelemek için uyarlanabilir. Canlı hücre görüntüleme için agarose pedleri yaparak başlayın. Yaklaşık 30 mL% 1 düşük suda eriyen agarose çözeltisi hazırlayın ve agarose tamamen çözülene kadar zaman zaman girdap yaklaşık 90 saniye boyunca bir cam şişesinde mikrodalga.
25 x 75 x 1.1mm cam kaydırağı nın bir tanesi diğerinin üzerine 25 x 75'in kenarına 22 x 22 x 22 kaydırak yerleştirin. Daha sonra, diğer kenarına küçük slaytlardan iki tane daha yığ. Pipet yaklaşık 1 mL erimiş agarose iki üst cam slayt lar arasında merkezi slayt içine ve erimiş agarose üstüne başka bir büyük slayt yerleştirin hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için emin olun.
15 dakika boyunca dört derece santigrat slaytlar serin sonra yavaşça küçük kareler halinde ped kesmek için bir neşter veya jilet kullanın. 25 x 75 x 1,1 mm'lik cam kaydıraktan çift taraflı yapışkan çerçeveyi düzeltin ve slayta birkaç ped yerleştirin. Legionella Pneumophila ağır bir yama çözmek 1 mL çift distile su.
Sonra girdap ve pipet 2-3 mikrolitre seyreltme pedleri üzerine. Yapışkan çerçevenin üzerine 58 x 24 x 0,15 mm kapak yerleştirin. Parlak alan ışığını kullanarak görüntüleme için hücreleri seçin.
Daha sonra, mikroskobun yazılımının yakalama penceresinde ND'yi 180'e, binning'i ikiye ikişer ayarlayın. 488 nanometre kanalını kullanarak numuneyi 500 ila 1000 milisaniye arasında teşrelemeyi yapın ve aynı parametrelere sahip etiketsiz Legionella Pneumophila'yı görüntüleyerek floresan özgüllüğünü doğrulayın. Polariteyi ölçmek için, görüntü kontrastını bakterilerin açıkça görülebilmesi için ayarlayın.
Daha sonra ilgi alanını yakınlaştırın ve kutuptan başlayıp sitoplazmaya doğru uzanan 0.25'e 1.3 mikrometrelik bir dikdörtgen yerleştirmek için bölge aracını kullanın ve dikdörtgenin bakteri sınırları içinde kalmasını sağlar. Analiz menüsündeki maske düğmesini kullanmak için bölgeyi kullanarak en az 200 bakteri işaretleyin ve maske oluşturun. Maske istatistiklerini tıklatın ve maske kapsamı altında nesne seçin.
Sonra özellikleri ve yoğunluğu altında yoğunluk ve varyans ortalama işareti. Verileri metin dosyası olarak dışa aktarın ve varyans ve ortalama yoğunluk arasındaki oran olarak her bakterinin polarite puanlarını hesaplamak için elektronik tablo uygulamasını kullanın. Yüksek iş elde uygulamaları için çift kanallı görüntüler elde etmek için yüz kontrastlı mikroskobu kullanın.
Bakterilerin tamamen ayrıldığı görüş alanlarını seçtiğinizden emin olun. Ardından, görüntünün yüz kanalı kontrastını bakterilerin açıkça görülebileceği bir seviyeye ayarlayın. Çift kanallı görüntüyü açın ve segment maskesi penceresi oluşturun.
Uygun eşiği ayarlayın, ardından nesneleri tanımla düğmesini tıklatarak ve en küçük boyutu 100 piksele ayarlayarak küçük nesneleri kaldırın. Hassas maskenin altında, kenarları kaldır nesnelerini ve birbirine bitişik bakterilerin ayrı maskelerini seçin. Füzyon proteinlerinin dinamiklerini ölçmek için görüntü yakalama penceresini açın ve zaman atlamasını işaretleyin.
Zaman puanı kutusuna iki tane girin. İlgi çekici protein ifade Legionella Pneumophila iki başarılı görüntüleri edinin. Hücreler açıkça görünene kadar görüntü kontrastını ayarlayın.
Daha sonra en az 400 hücrenin ortasına 0,25 ile 0,25 mikrometre kare yerleştirmek için bölge aracını kullanın. Ardından, ilgi karelerinin maskesini oluşturmak için çözümleme menüsündeki maske düğmesini kullanmak için bölgeyi kullanın. Yeni bir boş maske oluşturun ve en az 25 rasgele hücrenin tüm hücre alanını işaretlemek için piksel aracını kullanın.
Başka bir maske oluşturun ve hücreler arasındaki alanları işaretlemek için büyük fırça aracını kullanın. Son olarak, maske istatistiklerini seçin ve maske nin maske kapsamı altında nesnenin seçildiğinden emin olun. Özellikleri ve yoğunluğu altında, ortalama yoğunluğu seçin.
Verileri dışa aktarın ve maske 2 için işlemi tekrarlayın. Maske 3 için maskenin tamamını seçin ve ortalama yoğunluğu dışa aktarın. Elektron kriyotomografi örneğini hazırlamak için CYE Agrastreptomisum plakalarında 37 santigrat derecede 48 saat boyunca ağır bir Legionella Pneumophila parçası yetiştirin.
Sudaki hücreleri 0,7'nin od 600'üne geri alın. Sonra hücre süspansiyon 20 mikrolitre kolloidal altın parçacıkları beş mikrolitre ekleyin. Glow üzerinde hücre karışımı bir delikli karbon ızgara ve pipet beş mikrolitre deşarj.
Bir dakika bekletin. Izgarayı filtre kağıdıyla blotlayın ve yerçekimine dayalı bir piston cihazı kullanarak sıvı etan içinde dondurun. Legionella Pnömofili kromozomuna süper klasör GFP takıldıktan sonra floresan sinyali ebeveyn süper klasörü GFP negatif zorlanma ile karşılaştırmak için canlı hücre floresan mikroskobu yapıldı.
Buna ek olarak, parlak alan mikroskobu belirli bir floresan sinyali olan hücrelerin oranını incelemek için kullanılmıştır. DotB süper klasörGFP üretilen hücrelerin sadece bir kısmı füzyon proteinpolar lokalizasyon gösterdi. DotB floresan sinyalinin dağılımını karakterize ederken, kutuplarda DotB süper klasör GFP yoğunluğu sitosol yaklaşık iki kat daha yüksek olduğu bulundu.
DotB süper klasör GFP polar lokalizasyonunun tam olarak monte edilmiş tip dört salgı sistemine bağlı olup olmadığını araştırmak için, dotb süper klasör GFP polarite puanları vahşi tipteki hücreler için ve tip dört salgı sistemi mutantı için belirlendi. Nitekim, DotB süper klasör GFP polar konumlandırma Dot / ICM sistemi silindiğinde kayboldu. Dinamik desenler DotB ATPase dinamik bir sitosolik popülasyonda mevcut olduğunu ve geç evre montaj reaksiyonu kutup lokalize Dot / ICM tip dört salgı sistemine işe olduğunu gösterdi.
Yüksek iş yapma kriyo-ET, DotB süper klasörgingini ifade eden Legionella Pneumophila suşundaki bozulmamış tip dört salgı sistemi aygıtını görselleştirmek için kullanıldı. Hücrenin yeniden yapılandırılmasında hücre zarfına gömülü birden fazla Nokta/ICM makinesi saptandı. Nokta Btipi ve süper klasör GFP'nin bozulmamış tip dört salgı sistemi makinesine göre genel konumlandırması da belirlendi.
Üç boyutlu yüzey işlemeleri, süper klasör GFP'nin Sitoplazmik ATPase kompleksinin tabanında bir disk olarak biraraya gelen DotB hexamer'ın altına yerleştirildiğini göstermiştir. Bu tekniği denerken, görüntü edinimi devam etmeden önce füzyon proteinleri ve etiket sekresyon sisteminin işlevselliğini değerlendirmek için emin olun. Modelleme ve montaj, dinamik örüntüleri ve yapısal yoğunlukları analiz etmenin yanı sıra konformasyonel değişikliklerin değerlendirilmesi veya alt birimlerin yapıya yerelleştirilmesi için etkili yollar olabilir.
Bu yaklaşım, farklı tip dört gizli sistem bileşenlerinin nasıl çalıştığını, büyük karmaşık alanda nasıl etkileşimde bulunduklarını ve farklı alt derlemelerin hangi işlevleri gerçekleştirdiğini anlamada yardımcı olabilir.
