Este protocolo es útil para caracterizar las funciones de montaje de las complejidades de la secreción bacteriana y puede conducir a una comprensión fundamental de los mecanismos moleculares que se requieren para las interacciones de patógenos del huésped. Esta técnica integra enfoques complementarios que preservan la estructura nativa de la muestra y permite y ve a la visualización de complejos de proteínas en células bacterianas intactas. Aumenta nuestra comprensión de las relaciones de función estructural de los sistemas de secreción bacteriana.
Este método se puede adaptar para estudiar otros tipos de sistemas de secreción u otros complejos celulares en una amplia variedad de especies bacterianas. Comience por hacer almohadillas de agarosa para imágenes de células vivas. Preparar unos 30 ml de solución de agarosa de fusión 1% baja en agua y microondas en un matraz de vidrio durante unos 90 segundos arremolinando ocasionalmente hasta que la agarosa se disuelva por completo.
Coloque dos diapositivas de vidrio de 22 por 22 por 0,15 mm en el borde de un deslizable de vidrio de 25 por 75 por 1,1 mm uno encima del otro. A continuación, apile dos diapositivas más más en el otro borde. Pipetear aproximadamente 1 ml de la agarosa fundida en el tobogán central entre los dos portaobjetos de vidrio superior y colocar otro gran portaobjetos en la parte superior de la agarosa fundida asegurándose de evitar la formación de burbujas de aire.
Enfríe los portaobjetos a cuatro grados centígrados durante 15 minutos y luego use un bisturí o una cuchilla de afeitar para cortar suavemente la almohadilla en cuadrados pequeños. Fije un marco adhesivo de doble cara en una diapositiva de vidrio de 25 por 75 por 1,1 mm y coloque varias almohadillas en la diapositiva. Disolver un parche pesado de Legionella Pneumophila en 1 ml de agua doble destilada.
A continuación, vórtice y pipeta de dos a tres microlitros de la dilución en las almohadillas. Coloque suavemente un resbalón de cubierta de 58 por 24 por 0,15 mm sobre el marco adhesivo. Seleccione celdas para imágenes utilizando iluminación de campo brillante.
A continuación, en la ventana de captura del software del microscopio, ajuste el ND a 180 y el binning a dos por dos. Utilice el canal de 488 nanómetros para exponer la muestra durante 500 a 1000 milisegundos y validar la especificidad de la fluorescencia mediante la toma de imágenes de Legionella Pneumophila sin etiquetar con los mismos parámetros. Para cuantificar la polaridad, ajuste el contraste de la imagen para que las bacterias sean claramente visibles.
A continuación, haga zoom en la región de interés y utilice la herramienta de región para colocar un rectángulo de 0,25 por 1,3 micrómetros comenzando en el polo y extendiéndose en el citoplasma asegurándose de que el rectángulo permanezca dentro de los bordes bacterianos. Marque al menos 200 bacterias y cree máscaras utilizando el botón región para enmascarar en el menú Analizar. Haga clic en las estadísticas de la máscara y elija el objeto bajo el alcance de la máscara.
A continuación, marque la intensidad media y la varianza en características e intensidad. Exporte los datos como un archivo de texto y utilice la aplicación de hoja de cálculo para calcular las puntuaciones de polaridad de cada bacteria como la relación entre la varianza y la intensidad media. Para aplicaciones de alto rendimiento, utilice la microscopía de contraste facial para adquirir imágenes de doble canal.
Asegúrese de elegir los campos de vista donde las bacterias están completamente separadas. A continuación, ajuste el contraste del canal facial de la imagen a un nivel en el que las bacterias sean claramente visibles. Abra la imagen de doble canal e inicie la ventana crear máscara de segmento.
Ajuste el umbral adecuado y, a continuación, elimine los objetos pequeños haciendo clic en el botón Definir objetos y ajustando el tamaño mínimo a 100 píxeles. En Máscara de refinamiento, seleccione Eliminar objetos de bordes y máscaras separadas de bacterias adyacentes entre sí. Para cuantificar la dinámica de las proteínas de fusión, abra la ventana de captura de imágenes y marque el lapso de tiempo.
Introduzca dos en el cuadro Número de puntos de tiempo. Adquiera dos imágenes exitosas de Legionella Pneumophila expresando la proteína fluorescente de interés. Ajuste el contraste de la imagen hasta que las celdas sean claramente visibles.
A continuación, utilice la herramienta de región para colocar un cuadrado de 0,25 por 0,25 micrómetros en el medio de al menos 400 celdas. A continuación, utilice el botón región para enmascarar en el menú Analizar para crear una máscara de los cuadrados de interés. Crea una nueva máscara vacía y usa la herramienta de píxeles para marcar toda el área de celda de al menos 25 celdas aleatorias.
Cree otra máscara y utilice la herramienta de pincel grande para marcar áreas entre las celdas. Por último, seleccione las estadísticas de máscara y asegúrese de que el objeto está seleccionado en el ámbito de máscara para la máscara uno. En Características e intensidad, elija la intensidad media.
Exporte los datos y repita el proceso para la máscara 2. Para la máscara 3, seleccione toda la máscara y exporte la intensidad media. Para preparar la muestra de criotomografía de electrones, haga crecer un parche pesado de Legionella Pneumophila en placas CYE Agrastreptomisum durante 48 horas a 37 grados centígrados.
Resuspender las células en agua a un OD 600 de aproximadamente 0.7. A continuación, agregue cinco microlitros de partículas de oro coloidal a 20 microlitros de la suspensión celular. Glow descarga una rejilla de carbono holey y pipeta cinco microlitros de la mezcla celular en ella.
Déjalo reposar un minuto. Borre la rejilla con papel de filtro y congénelo en etano líquido utilizando un aparato de émbolo accionado por gravedad. Después de insertar la supercarpeta GFP en el cromosoma Legionella Pneumophila, se realizó una microscopía fluorescente de células vivas para comparar la señal fluorescente con la de la cepa negativa GFP supercarpeta parental.
Además, se utilizó una microscopía de campo brillante para examinar la proporción de células con una señal fluorescente específica. Sólo una fracción de las células que produjeron dotB superfolder GFP mostró la localización polar de la proteína de fusión. Al caracterizar la distribución de la señal fluorescente DotB, se encontró que la intensidad de la supercarpeta DotB GFP en los polos era aproximadamente dos veces mayor que en el citosol.
Para investigar si la localización polar GFP de la supercarpeta DotB dependía de un sistema de secreción de tipo cuatro completamente ensamblado, se determinaron las puntuaciones de polaridad de la supercarpeta DotB GFP para células individuales en un tipo salvaje, y en un sistema de secreción tipo cuatro mutante. De hecho, el posicionamiento polar de la supercarpeta DotB GFP desapareció cuando se eliminó el sistema Dot/ICM. Los patrones dinámicos indicaban que el DotB ATPase estaba presente en una población citosólica dinámica y fue reclutado para el sistema de secreción de tipo cuatro Punto/ICM localizado polar en una reacción de ensamblaje en etapa tardía.
Crio-ET de alto rendimiento se utilizó para visualizar el aparato del sistema de secreción de tipo cuatro intacto en una cepa de Legionella Pneumophila que expresa la supercarpeta DotB GFP. La reconstrucción de la célula reveló varias máquinas Dot/ICM incrustadas en el sobre de la celda. También se determinó el posicionamiento general de DotB y superfolder GFP en relación con la máquina del sistema de secreción de tipo cuatro intacta.
Las representaciones superficiales tridimensionales indicaron que la supercarpeta GFP se coloca debajo del hexámero DotB, que se ensambla como un disco en la base del complejo ATPase citoplasmático. Al intentar esta técnica, asegúrese de evaluar la estabilidad de las proteínas de fusión y la funcionalidad del sistema de secreción de etiquetas antes de proceder a la adquisición de imágenes. El modelado y el ajuste pueden ser formas eficaces de analizar los patrones dinámicos y las densidades estructurales, así como para la evaluación de los cambios de conformacionalización o la localización de subunidades en la estructura.
Este enfoque puede ayudar a comprender cómo funcionan los distintos componentes secretos del sistema, cómo interactúan dentro del complejo mayor y qué funciones realizan los distintos subensamblajes.
