פרוטוקול זה שימושי לאפיון פונקציות ההרכבה של מתחמי הפרשת חיידקים והוא יכול להוביל להבנה בסיסית של המנגנונים המולקולריים הנדרשים לאינטראקציות פתוגן מארח. טכניקה זו משלבת גישות משלימות המשמרות את המבנה הטבעי של המדגם ומאפשרות ומראות הדמיה של קומפלקסים חלבונים בתאי חיידקים שלמים. זה מגביר את ההבנה שלנו של יחסי תפקוד מבניים של מערכות הפרשת חיידקים.
שיטה זו יכולה להיות מותאמת לחקר סוגים אחרים של מערכות הפרשה או מתחמים סלולריים אחרים במגוון רחב של מינים חיידקיים. התחל על ידי ביצוע רפידות agarose עבור הדמיה של תאים חיים. הכינו כ-30 מ"ל של תמיסת אגרוז נמסה נמוכה במים וקצו אותו בבקבוק זכוכית במשך כ-90 שניות ומסתחררים אותו מדי פעם עד שהאגרוז מומס לחלוטין.
מקום שתי שקופיות זכוכית 22 על 22 על ידי 0.15mm על קצה של 25 על ידי 75 על ידי 1.1mm שקופית זכוכית אחד על גבי השני. לאחר מכן, חסוף שתי שקופיות קטנות יותר בקצה השני. פיפטה על 1 מ"ל של מותך התעורר לתוך השקופית המרכזית בין שתי מגלשות זכוכית העליון ולמקום שקופית גדולה נוספת על גבי אגרוז מותך הקפדה להימנע היווצרות של בועות אוויר.
מצננים את השקופיות בארבע מעלות במשך 15 דקות ואז משתמשים באזמל או בסכין גילוח כדי לחתוך בעדינות את הפנקס לריבועים קטנים. תקן מסגרת דבק דו-צדדית על מגלשת זכוכית של 25 על 75 על 1.1 מ"מ והצב מספר רפידות במגלשה. ממיסים חלקה כבדה של לגיונלה Pneumophila ב 1 מ"ל של מים מזוקקים כפולים.
ואז מערבולת ופיגט 2-3 מיקרוליטרים של הדילול על הרפידות. מניחים בעדינות כיסוי 58 על 24 על 0.15 מ"מ מעל מסגרת דבק. בחר תאים להדמיה באמצעות תאורת שדה בהירה.
לאחר מכן, בחלון הלכידה של תוכנת המיקרוסקופ, כוונן את ה- ND ל- 180 ואת התאם לשניים על שניים. השתמש בערוץ 488 ננומטר כדי לחשוף את המדגם עבור 500 עד 1000 אלפיות שנייה ולאמת את הספציפיות של הפלואורסצנטיות על ידי הדמיה לגיונלה Pneumophila untagged עם אותם פרמטרים. לכמת את הקוטביות, התאימו את ניגודיות התמונה כך שהחיידקים יהיו גלויים בבירור.
לאחר מכן הגדל את אזור העניין ולהשתמש בכלי האזור כדי למקם מלבן 0.25 על 1.3 מיקרומטר החל בקוטב ולהרחיב לתוך הציטופלסמה ולוודא כי המלבן נשאר בתוך גבולות החיידקים. סמן לפחות 200 חיידקים וצור מסכות באמצעות האזור כדי להסוות כפתור בתפריט הניתוח. לחצו על סטטיסטיקת המסיכה ובחרו עצם תחת טווח מסיכה.
לאחר מכן סמן עוצמה ושונות ממוצעות תחת תכונות ועוצמה. יצא את הנתונים כקובץ טקסט ולהשתמש ביישום הגיליון האלקטרוני כדי לחשב את ציוני הקוטביות של כל חיידק כיחס בין השונות לבין העוצמה הממוצעת. עבור יישומי תפוקה גבוהה השתמש במיקרוסקופיה של ניגודיות פנים כדי להשיג תמונות ערוץ כפול.
הקפד לבחור שדות תצוגה שבהם החיידקים מופרדים לחלוטין. לאחר מכן, התאימו את ניגודיות ערוץ הפנים של התמונה לרמה שבה החיידקים נראים בבירור. פתחו את תמונת הערוץ הכפול וה הפעלו את חלון יצירת מסיכת המקטע.
התאימו את הסף המתאים ולאחר מכן הסירו את העצמים הקטנים בלחיצה על לחצן 'הגדר אובייקטים' והתאמת הגודל המינימלי ל- 100 פיקסלים. תחת מסיכת עידון, בחר להסיר עצמים בקצוות ומסיכות נפרדות של חיידקים הסמוכים זה לזה. לכימות הדינמיקה של חלבוני ההיתוך, פתחו את חלון לכידת התמונה וסמן את דעך הזמן.
הזן שתיים בתיבה מספר נקודות זמן. לרכוש שתי תמונות מוצלחות של לגיונלה Pneumophila להביע את החלבון פלואורסצנטי של עניין. התאימו את חדות התמונה עד שהתאים יהיו גלויים בבירור.
לאחר מכן השתמש בכלי האזור כדי למקם ריבוע מיקרומטר של 0.25 על 0.25 באמצע לפחות 400 תאים. לאחר מכן, השתמשו באזור למסיכה בתפריט 'ניתוח' ליצירת מסיכה של ריבועים מעניינים. צרו מסיכה ריקה חדשה ולהשתמש בכלי הפיקסלים לסי סימון כל אזור התא של לפחות 25 תאים אקראיים.
צרו מסיכה נוספת ולהשתמש בכלי המברשת הגדול לסי סימון אזורים בין התאים. לבסוף, בחרו סטטיסטיקת מסיכה ודאו שהעצם נבחר תחת טווח מסיכה למסיכה אחת. תחת תכונות ועוצמה, בחר בעוצמה ממוצעת.
יצא את הנתונים וחזור על התהליך עבור מסיכה 2. למסיכה 3, בחרו בכל המסיכה וייצאו את העוצמה הממוצעת. כדי להכין את דגימת קריוטומוגרפיה אלקטרונים, לגדל חלקה כבדה של לגיונלה Pneumophila על CYE Agrastreptomisum צלחות במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
תן שימוש חוזר בתאים במים ל- OD 600 של כ- 0.7. לאחר מכן להוסיף חמישה microliters של חלקיקי זהב קולואידי ל 20 microliters של ההשעיה התא. זוהר לפרוק רשת פחמן חורי פיפטה חמישה microliters של תערובת התא על זה.
תן לזה לעמוד לדקה אחת. תצלום את הרשת עם נייר סינון ותקפיא אותה באתן נוזלי באמצעות מנגנון בוכנה מונחה כבידה. לאחר החדרת GFP superfolder לתוך כרומוזום לגיונלה Pneumophila, מיקרוסקופיה פלואורסצנטי תא חי בוצעה כדי להשוות את האות פלואורסצנטי עם זה של זן שלילי GFP superfolder ההורים.
בנוסף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של שדה בהיר כדי לבחון את שיעור התאים עם אות פלואורסצנטי ספציפי. רק חלק קטן מהתאים שייצרו את GFP של תיקיית העל DotB הציג לוקליזציה קוטבית של חלבון ההיתוך. כאשר אפיינו את התפלגות האות הפלואורסצנטי של DotB, נמצא כי עוצמת ה- GFP של סופרפליפר DotB בקטבים הייתה גבוהה פי שניים בערך מאשר בציטוסול.
כדי לחקור אם לוקליזציה קוטבית GFP של DotB הייתה תלויה במערכת הפרשת סוג 4 שהורכבה במלואה, נקבעו ציוני קוטביות של GFP של תיקיית-על DotB עבור תאים בודדים בסוג פראי, ובמוטנט מערכת הפרשות מסוג 4. ואכן, מיקום הקוטב של DotB superfolder GFP נעלם כאשר מערכת Dot / ICM נמחקה. דפוסים דינמיים הצביעו על כך שה- DotB ATPase היה נוכח באוכלוסייה ציטוסולית דינמית וגויס למערכת הפרשת דוט/ICM מקוטבת מסוג 4 בתגובת הרכבה בשלב מאוחר.
cryo-ET תפוקה גבוהה שימש כדי לדמיין את מנגנון מערכת הפרשת סוג ארבע שלם במתח לגיונלה Pneumophila המבטא DotB superfolder GFP. שחזור התא חשף מכונות Dot/ICM מרובות המוטבעות במעטפת התא. המיקום הכולל של DotB ו GFP superfolder ביחס לסוג שלם ארבע מכונת מערכת הפרשה נקבעה גם.
עיבודי משטח תלת מימדיים הצביעו על כך ש- GFP של תיקיית העל ממוקם מתחת להקסמר DotB, אשר מתכנס כדיסק בבסיס קומפלקס ATPase הציטופלסמי. בעת ניסיון טכניקה זו, הקפד להעריך את היציבות של חלבוני ההיתוך ואת הפונקציונליות של מערכת הפרשת התגים לפני שתמשיך לרכישת תמונה. מידול והתאמה יכולים להיות דרכים יעילות לנתח את הדפוסים הדינמיים ואת הצפיפות המבנית, כמו גם להערכת שינויים קונפורמיים או לוקליזציה של תת-יוניות לתוך המבנה.
גישה זו יכולה לסייע בהבנת אופן הפעולה של רכיבי מערכת סודיים מסוג ארבע שונים, כיצד הם מקיימים אינטראקציה בתוך המורכבות הגדולה יותר ומהן הפונקציות שפונקציות של תתי-קומפלקסים שונים מבצעות.
