Хроматин иммунопреципиентации следуют секвенирования, или ChIP-seq, это метод, который может быть использован для обнаружения нормативных целей транскрипционных факторов, модификации гистона, и другие ДНК-ассоциированных белков. В ChIP-seq собирают клетки и ДНК-связывающий белок. пересекается с ДНК in vivo с формальдегидом.
Клетки лизированы, высвобождая содержимое клетки и хроматин сноется на фрагменты менее 1000 базовых пар, как правило, между 200 и 600 базовых пар. ДНК, взаимодействующая с целевым белком, иммунопрецилитирована с помощью антител и изолирована путем де-перекрестного пересечения. Перекрестные ссылки белка ДНК меняются, а РНК и белок перевариваются.
ДНК очищается, делается в библиотеки и секвенируется. Данные ChIP-seq также могут быть использованы для дифференцированной привязки транскрипционных факторов в различных условиях окружающей среды или типах клеток. Первоначально ChIP проводился путем гибридизации на микроаррее.
Однако секвенирование ChIP стало предпочтительным методом благодаря технологическим достижениям, уменьшению финансовых барьеров на пути последовательности и массовому выходу высококачественных данных. В этом протоколе мы продемонстрируем методы выполнения ChIP-seq с бактериальными биопленки, основным источником стойких и хронических инфекций. ChIP-seq будет выполняться на биопленке сальмонеллы typhimurium и планктонных клетках, ориентируясь на главного регулятора биопленки, CSGD, для определения дифференциальной привязки в двух типах клеток.
В этом видео мы продемонстрируем методы определения соответствующего количества биопленки для сбора урожая, нормализации работы с образцом планктонного контроля, гомогенизации биопленки для перекрестного доступа и выполнения рутинных шагов ChIP-seq для получения высококачественных результатов секвенирования. Streak пластины сальмонеллы enterica служить нашим typhimurium на пластине LB агар, чтобы изолировать колонии и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье. Привить бульон из пяти мл LB с одной-тремя колониями от полосы пластины и инкубировать при 37 градусах по Цельсию с встряхивания в течение семи часов или журнал роста.
Найдите оптическую плотность культуры колбы на 600 нанометров, используя спектрофотометр, и добавьте один эквивалент культуры клеток OD 600 или 10 к девяти клеткам в колбу Erlenmeyer, содержащую 100 миллилитров одного процента триптона. Инкубировать при 28 градусах по Цельсию при встряхивании в течение 13 часов. Биопленочные клетки появляются как агрегированные хлопья, а одиночные планктонные клетки находятся в облачных условиях.
Биопленка очень устойчива и прилипает к бокам трубок и пипеток. Мы используем условные средства массовой информации для перемещения биопленки на начальном этапе и использовать теплые PBS непосредственно перед перекрестной ссылкой, чтобы удалить белок перекрестных субстратов в средствах массовой информации. Исследователям, возможно, потребуется найти подходящее решение для повторной приостановки биопленки.
Соберите культуру колбы в центрифуге трубки и центрифуги при 12 000 Г в течение 10 минут при 10 градусах цельсия. Ввекать супернатант в блок фильтра 0,2 микрометра и вакуумный фильтр. Культура колбы Aliquot в пробки и центрифугу на медленной скорости, чтобы отделить два типа клеток.
Биопленочные клетки находятся в гранулах в нижней части трубки и одиночные клетки находятся в облачном супернатанте. Pipette супернатант, содержащий планктонные клетки в центрифугу трубки на потом. 25 микрограммов ДНК рекомендуется в качестве ввода для экспериментов ChIP-seq.
В нашем случае 30 миллиграммов биопленки дают около 25 микрограммов ДНК. Поскольку биопленопленонные агрегаты имеют обилие белкового внеклеточного материала, оно конкурирует за кросслинкер и может привести к неравному перекрестному продукту, представленного для иммунопреципиентации. Предлагается протеиновый анализ для определения эквивалентного клеточного материала по концентрации белка.
В этом случае, шесть OD 600 планктонных клеток собирают в качестве контроля за 30 миллиграммов биопленки. Биопленка собирается мокрый вес и колонии сельскохозяйственных единиц биопленки можно найти с помощью коэффициента преобразования показано. Исследователям рекомендуется найти коэффициент конверсии видов биопленки, с помощью которых они работают путем гомогенизации и разбавления капель.
Повторно приостановить биопленки гранулы в один миллилитр условных триптон и перейти в предварительно взвешенных два миллилитров оснастки крышка или винт крышка трубки. Центрифуга в течение одной минуты в 11 000 Г. Удалите супернатант из трубки и взвесите трубку точно. Вычесть вес трубки из веса трубки с биопленкой, чтобы найти вес агрегатов.
Она должна быть в пределах 10% от целевого веса биопленки. Добавьте один миллилитр PBS и вихря, чтобы повторно приостановить биопленку агрегатов. Выделяй супернатант от медленной центрифугации скорости в центрифугные трубки.
Измерьте оптическую плотность планктонных клеток на 600 нанометров с помощью спектрофотометра и рассчитайте необходимый объем для окончательного OD 600 из шести. Охладить центрифугу Флоры до 10 градусов по Цельсию и гранулировать планктонные клетки с помощью центрифуги Флоры. Центрифуга при 10 000 Г в течение 10 минут при 10 градусах Цельсия.
Удалите супернатант и повторно приостановить гранулы в PBS. Remeasure OD 600 планктонных клеток с помощью спектрофотометра и обойтись объемом шесть OD 600 планктонных клеток в два миллилитров оснастки крышка или винт крышка трубки. Биопленочные агрегаты должны быть разбиты на части, чтобы позволить кросслинкеру получить доступ к ячейкам.
Планктонные клетки обрабатываются так же, как биопленочные клетки для уменьшения переменных. Использование металлических бусин в смеситель мельницы может быть более эффективным для распада биопленки, чем стекло ткани гомогенизаторов. Асептически, добавить один стерилизованный металлический шарик для каждой из трубок.
Гомогенизировать с помощью смесителя мельницы в течение пяти минут на 30 Герц. Наблюдайте агрегатные трубки, чтобы подтвердить, что биопленка была разбита на части перед передачей гомогенизированных клеток в новую 1,5 миллилитровую трубку, избегая металлического шарика. Довнесите громкость до одного миллилитра с помощью PBS.
На данный момент, это необязательно для выполнения разбавления капли, чтобы перечислить входные ячейки. Раздай свежий формальдегид в пробные трубки до конечной концентрации в один процент. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре на вращающемся колесе.
Добавьте глицин в окончательную концентрацию 125 миллимоля для утоления перекрестных связей и инкубации в течение пяти минут при комнатной температуре на вращающемся колесе. Чтобы вымыть клетки и удалить избыток кросслинкера, центрифуга в течение трех минут при 8000 Г и удалить супернатант. Повторно приостанавливайте гранулы в ингибиторах протеазы и 500 микролитров фильтра стерилизованного PBS.
Повторно приостанавливайте гранулы в 600 микролитров буфера лиза и инкубировать на льду в течение 10 минут. Переместив частичный lysate на новую трубку, содержащую 1,4 миллилитров буфера разбавления ИС. Держите на льду в течение полутора-двух часов и вихрь время от времени.
Некоторые устойчивые материалы могут оставаться в трубках. Тем не менее, длительный инкубационный период и случайные вихри будут распадаться агрегированный материал, а остальная часть будет нарушена во время sonication. Настройте звуковой.
Поместите 15 миллилитровую трубку в стакан со льдом и поместите зонд внутрь трубки. Импульс на 20 до 40 процентов в течение пяти звуковых очередей 30 секунд и прохладно между sonication раундов. Лисат клетки будет казаться облачным перед sonication и появится ясно после sonication.
Чтобы удалить осажденный материал, центрифуга при 8000 Г в течение 10 минут при четырех градусах и обойтись супернатант в новую трубку, избегая черных гранул. Передача энергии Sonicator и сопротивление типа клетки могут отличаться, поэтому анализ звуковой данных рекомендуется найти количество звуковых раундов, которые будут производить диапазон размеров фрагментов, необходимых для подготовки и секвенирования библиотеки ниже по течению. Распределение звуковой ДНК в один 1,35 миллилитр aliquot для иммунопреципиентации и один 200 микролитр aliquot в качестве входной ДНК.
Держите контроль входных данных на уровне минус 80 градусов по Цельсию до де-перекрестного пересечения и переваривания шагов. После тестирования антител, чтобы обеспечить их специфичность для целевого белка, добавить антитела к иммунопреципиентации труб и инкубировать при четырех градусах цельсия ночь на вращающемся колесе. Добавьте 50 микролитров белка G магнитных бусин и инкубировать при четырех градусах по Цельсию на вращающемся колесе в течение трех часов.
Свяжите бисер по бокам труб с помощью магнитного стенда и выполнить моет. Вымойте дважды с 750 микролитров холодного IP мыть буфера один. Вымойте один с 750 микролитров холодного IP мыть буфера два.
И мыть дважды с 750 микролитров холодного TE при рН восемь. Держите трубки на магнитной подстоять во время моет. Добавьте 450 микролитров буфера IP elution в каждую трубку и инкубировать при 65 градусах по Цельсию в течение 30 минут с нежным вихрем каждые пять минут.
Свяжите бисер по бокам труб с помощью магнитной подготовки. Подождите, по крайней мере две минуты, пока раствор не прояснит, а затем обойтись без очищенного раствора до новой 1,5 миллилитровой трубки. Чтобы обратить вспять поперечные ссылки и переварить РНК, добавьте два микрограмма RNase восемь и добавить хлорид натрия к вашей окончательной концентрации 0,3 молара в каждой трубке.
Инкубировать при 65 градусах по Цельсию в течение более шести часов или на ночь. Чтобы переварить белок, добавьте 180 микрограммов протеиназы K в каждую трубку и инкубировать при 45 градусах по Цельсию в течение трех-пяти часов. Очисти ДНК.
Магнитные бусины предпочтительнее для изоляции небольшого количества ДНК, восстановленной во время CHIP с бактериальными клетками. Тем не менее, колонка на основе или фенилхлороформная экстракция может адекватно восстановить ДНК ChIP. После очистки библиотеки готовятся из очищенной ДНК ChIP с помощью комплекта, совместимого с выбранной платформой секвенирования.
Библиотеки ДНК ChIP часто требуют добавления минимального количества адаптеров и выполнения максимального количества циклов усиления ПЦР. Проверьте размер библиотеки с помощью биоанализа и проверьте концентрацию библиотеки с помощью кубилита или комплекта количественной оценки библиотеки КЗКР. Объединить библиотеки и продолжить секвенирование в соответствии со спецификацией выбранной платформы.
Анализ данных ChIP-seq требует качества скоринговой базы, обрезки некачественных баз, выравнивания сборки с эталонным геномом, вызова пиков, связывания пиков с генами и анализа чрезмерно представленных связывающих мотивов. Данные ChIP-seq обычно имеют низкий уровень фона. ДНК, которая контролируется белком, на который нацелена иммунопреципиентация, будет обогащена и появится в качестве пиков, которые, по крайней мере, в два раза выше фона.
В этом видео мы описали методы выполнения ChIP-seq на биопленки сальмонеллы и одиночных планктонных клетках, которые дают пики обогащенной ДНК в генах, контролируемых фактором транскрипции, представляющим интерес. Большинство бактериальной жизни в природе, как полагают, существуют в биопленки и до 40% заболеваний человека, как полагают, биопленки связаны между собой. Таким образом, они имеют огромные медицинские и экономические последствия.
Тем не менее, биопленка устойчива и труднее перечислить, открыть, и манипулировать. Исследователи могут использовать методы ChIP-seq, которые мы описали, чтобы собрать соответствующее количество биопленки, гомогенизировать биопленку, лизные клетки, sonicate, выполнять иммунопреципитацию, очищать и последовательность ДНК от других биопленообразующих бактериальных видов.
