Individuazione degli obiettivi normativi CsgD nel biofilm della Salmonella mediante l'immunoprecipitazioni della cromatina e il sequenziamento ad alto rendimento (ChIP-seq)

L'immunoprecipitazione della cromatina seguita dal sequenziamento, o ChIP-seq, è una tecnica che può essere utilizzata per scoprire gli obiettivi regolatori dei fattori di trascrizione, le modifiche istonali e altre proteine associate al DNA. Nel ChIP-seq, le cellule vengono raccolte e la proteina legante il DNA. è collegato al DNA in vivo con formaldeide.

Le cellule vengono lese, rilasciando il contenuto della cella e la cromatina viene tranciata in frammenti di meno di 1000 coppie di basi, di solito tra le 200 e le 600 coppie di basi. Il DNA, interagendo con la proteina bersaglio, è immunoprecipitato usando anticorpi e isolato dal de-crosslinking. I collegamenti incrociati delle proteine del DNA sono invertiti e l'RNA e le proteine vengono digeriti.

Il DNA viene purificato, trasformato in librerie e sequenziato. I dati ChIP-seq possono anche essere utilizzati per trovare il legame differenziale dei fattori di trascrizione in diverse condizioni ambientali o tipi di cellule. Inizialmente, chip è stato eseguito attraverso l'ibridazione su un microarray.

Tuttavia, il sequenziamento chip è diventato il metodo preferito a causa dei progressi tecnologici, della diminuzione degli ostacoli finanziari al sequenziamento e dell'enorme output di dati di alta qualità. In questo protocollo, dimostreremo tecniche di esecuzione di ChIP-seq con biofilm batterici, una delle principali fonti di infezioni persistenti e croniche. ChIP-seq verrà eseguito su biofilm salmonella typhimurium e cellule planctoniche, rivolgendo il regolatore principale del biofilm, CSGD, per determinare il legame differenziale nei due tipi di cellule.

In questo video, dimostreremo tecniche per determinare la quantità appropriata di biofilm da raccogliere, normalizzare in un campione di controllo planctonico, omogeneizzare il biofilm per l'accesso al retino incrociato ed eseguire passaggi di routine chIP-seq per ottenere risultati di sequenziamento di alta qualità. La salmonella enterica a piastre striata serve il nostro typhimurium su una piastra di agar LB per isolare le colonie e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Inoculare cinque mL brodo LB con una o tre colonie dalla piastra striata e incubare a 37 gradi Celsius con scuotimento per sette ore o per registrare la crescita.

Trova la densità ottica della coltura del pallone a 600 nanometri, usando uno spettrofotometro e aggiungi un equivalente OD 600 della coltura cellulare o 10 alle nove cellule a un pallone Erlenmeyer contenente 100 millilitri di tripptone dell'uno per cento. Incubare a 28 gradi Celsius con tremare per 13 ore. Le cellule del biofilm appaiono come fiocchi aggregati e singole cellule planctoniche sono nei mezzi nuvolosi.

Il biofilm è altamente resistente e si attacca ai lati di tubi e punte di pipetta. Utilizziamo supporti condizionati per spostare inizialmente il biofilm e utilizziamo PBS caldo immediatamente prima del collegamento incrociato per rimuovere i substrati di retille proteiche nel supporto. I ricercatori potrebbero aver bisogno di trovare una soluzione appropriata per sospendere di nuovo il biofilm.

Raccogliere la coltura del pallone in un tubo di centrifuga e centrifugare a 12.000 G per 10 minuti a 10 gradi Celsius. Decantare il supernatante in un'unità filtrante da 0,2 micrometri e in un filtro sottovuoto. Coltura del pallone aliquota in tubi e centrifuga a bassa velocità per separare i due tipi di cellule.

Le cellule del biofilm sono nel pellet nella parte inferiore del tubo e le singole cellule si trovano nel supernatante torbido. Pipettare il supernatante contenente cellule planctoniche in un tubo di centrifuga per un secondo momento. 25 microgrammi di DNA sono raccomandati come input per esperimenti ChIP-seq.

Nel nostro caso, 30 milligrammi di biofilm producono circa 25 microgrammi di DNA. Poiché gli aggregati di biofilm hanno un'abbondanza di materiale extracellulare proteico, compete per il crosslinker e può comportare un prodotto reticente ineguale presentato per l'immunoprecipitazione. Viene suggerito un saggio proteico per determinare il materiale cellulare equivalente per concentrazione proteica.

In questo caso, sei cellule planctoniche OD 600 vengono raccolte come controllo per 30 milligrammi di biofilm. Il biofilm viene raccolto dal peso umido e le unità agricole della colonia di biofilm possono essere trovate usando il fattore di conversione mostrato. I ricercatori sono incoraggiati a trovare il fattore di conversione delle specie che formano biofilm con cui lavorano mediante omogeneizzazione e diluizioni delle goccia.

Sospendere di nuovo il pellet di biofilm in un millilitro di triptono condizionato e passare in un tappo a scatto pre-pesato da due millilitri o in un tubo del tappo a vite. Centrifugare per un minuto a 11.000 G.Rimuovere il supernatante dal tubo e pesare il tubo con precisione. Sottrarre il peso del tubo dal peso del tubo con biofilm per trovare il peso degli aggregati.

Dovrebbe essere entro il 10% del peso del biofilm target. Aggiungere un millilitro di PBS e vortice per sospendere di nuovo gli aggregati di biofilm. Erogare il supernatante dalla centrifugazione a bassa velocità in tubi di centrifuga.

Misurare la densità ottica delle cellule planctoniche a 600 nanometri usando uno spettrofotometro e calcolare il volume richiesto per un OD finale 600 di sei. Raffreddare la centrifuga Flora a 10 gradi Celsius e pelletare le cellule planctoniche usando la centrifuga Flora. Centrifuga a 10.000 G per 10 minuti a 10 gradi Celsius.

Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in PBS. Rimisurare l'OD 600 delle celle planctoniche utilizzando uno spettrofotometro e distribuire il volume di sei celle planctoniche OD 600 in un tappo a scatto a due millilitri o in un tubo a vite. Gli aggregati di biofilm devono essere suddivisi per consentire al retino di accedere alle cellule.

Le cellule planctoniche sono trattate allo stesso modo delle cellule del biofilm per ridurre le variabili. L'uso di perline metalliche in un mulino miscelatore può essere più efficace per smontare il biofilm rispetto agli omogeneizzatori di tessuti di vetro. A livello asettico, aggiungere una perla metallica sterilizzata a ciascuno dei tubi.

Omogeneizzare utilizzando un miscelatore per cinque minuti a 30 Hertz. Osservare i tubi aggregati per confermare che il biofilm è stato scomposto prima di trasferire le cellule omogeneizzate in un nuovo tubo da 1,5 millilitri, evitando il tallone metallico. Portare il volume a un millilitro con PBS.

A questo punto, è facoltativo eseguire diluizioni di rilascio per enumerare le celle di input. Distribuire formaldeide fresca in tubi campione ad una concentrazione finale dell'uno per cento. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una ruota rotante.

Aggiungere la glicina a una concentrazione finale di 125 millimolare per temprare il cross-linking e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente su una ruota rotante. Per lavare le cellule e rimuovere il retino in eccesso, centrifugare per tre minuti a 8.000 G e rimuovere il supernatante. Sospendere di nuovo il pellet in inibitori della proteasi e 500 microlitri di PBS sterilizzato a filtro.

Sospendere di nuovo il pellet in 600 microlitri di tampone di lisi e incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Spostare il lisato parziale su un nuovo tubo contenente 1,4 millilitri di tampone di diluizione IP. Tenere sul ghiaccio per un'ora e mezza o due ore e vortice di tanto in tanto.

Alcuni materiali resistenti possono rimanere nei tubi. Tuttavia, un lungo periodo di incubazione e un vortice occasionale romperanno il materiale aggregato e il resto verrà rotto durante la sonicazione. Sintonizza il sonicatore.

Posizionare il tubo da 15 millilitri in un bicchiere di ghiaccio e posizionare la sonda all'interno del tubo. Pulsare dal 20 al 40% per cinque raffiche di sonicazione di 30 secondi e raffreddarsi tra un round di sonicazione e l'altro. Il lisato cellulare apparirà torbido prima della sonicazione e apparirà chiaro dopo la sonicazione.

Per rimuovere il materiale precipitato, centrifugare a 8.000 G per 10 minuti a quattro gradi e erogare il supernatante in un nuovo tubo, evitando il pellet nero. Il trasferimento di energia del sonicatore e la resistenza al tipo di cella possono differire, quindi si consiglia un test di sonicazione per trovare il numero di tondi di sonicazione che produrranno l'intervallo di dimensioni dei frammenti richiesto per la preparazione e il sequenziamento della libreria a valle. Distribuire il DNA sonicato in un'aliquota di 1,35 millilitri per l'immunoprecipitazione e in un'aliquota di 200 microlitri come DNA in ingresso.

Mantenere il controllo di input a meno 80 gradi Celsius fino a quando non si scollegano e si digeriscono i passaggi. Dopo aver testato gli anticorpi per garantirne la specificità per la proteina bersaglio, aggiungere l'anticorpo ai tubi di immunoprecipitazione e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte su una ruota rotante. Aggiungere 50 microlitri di perline magnetiche proteina G e incubare a quattro gradi Celsius su una ruota rotante per tre ore.

Legare le perline ai lati dei tubi utilizzando un supporto magnetico ed eseguire lavaggi. Lavare due volte con 750 microlitri di tampone di lavaggio IP freddo uno. Lavare uno con 750 microlitri di tampone di lavaggio IP freddo due.

E lavare due volte con 750 microlitri di TE freddo a pH otto. Tenere i tubi sul supporto magnetico durante i lavaggi. Aggiungere 450 microlitri di tampone di eluizione IP a ciascun tubo e incubare a 65 gradi Celsius per 30 minuti con vortici delicati ogni cinque minuti.

Legare le perline ai lati dei tubi utilizzando un supporto magnetico. Attendere almeno due minuti prima che la soluzione sia chiara e quindi erogare la soluzione cancellata a un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Per invertire i collegamenti incrociati e digerire l'RNA, aggiungere due microgrammi di RNasi otto e aggiungere cloruro di sodio alla concentrazione finale di 0,3 molare in ogni tubo.

Incubare a 65 gradi Celsius per più di sei ore o durante la notte. Per digerire le proteine, aggiungere 180 microgrammi di proteinasi K ad ogni tubo e incubare a 45 gradi Celsius per tre o cinque ore. Purifica il DNA.

Le perle magnetiche sono preferite per isolare le piccole quantità di DNA recuperate durante il ChIP con cellule batteriche. Tuttavia, l'estrazione a colonna o fenilcloroforme può recuperare adeguatamente il DNA del ChIP. Dopo la purificazione, le librerie vengono preparate dal DNA ChIP purificato utilizzando un kit compatibile con la piattaforma di sequenziamento selezionata.

Le librerie di DNA ChIP spesso richiedono l'aggiunta della quantità minima di adattatori e l'esecuzione del numero massimo di cicli di amplificazione PCR. Controlla le dimensioni della libreria con un bioanalizzatore e controlla la concentrazione della libreria con un cubito o un kit di quantificazione della libreria QPCR. Mettere in comune le librerie e procedere con il sequenziamento in base alle specifiche della piattaforma selezionata.

L'analisi dei dati ChIP-seq richiede il punteggio della qualità della base, il taglio di basi di bassa qualità, l'allineamento di letture di un assieme a un genoma di riferimento, la chiamata dei picchi, l'associazione dei picchi ai geni e l'analisi di motivi di legame sovrarappresentati. I dati ChIP-seq di solito hanno un basso livello di background. Il DNA controllato dalla proteina presa di mira dall'immunoprecipitazione sarà arricchito e apparirà come picchi che sono almeno due volte sopra lo sfondo.

In questo video, abbiamo descritto metodi per eseguire chIP-seq su biofilm di salmonella e singole cellule planctoniche che produce picchi di DNA arricchito nei geni controllati dal fattore di trascrizione di interesse. Si pensa che la maggior parte della vita batterica in natura esista nei biofilm e si pensa che fino al 40% delle malattie umane sia correlata al biofilm. Quindi hanno enormi impatti medici ed economici.

Tuttavia, il biofilm è resistente e più difficile da enumerare, aprire e manipolare. I ricercatori possono utilizzare le tecniche ChIP-seq che abbiamo descritto per raccogliere una quantità appropriata di biofilm, omogeneizzare il biofilm, le cellule di lisci, sonicare, eseguire immunoprecipitazione, purificare e sequenziare il DNA da altre specie batteriche che formano biofilm.