Chromatin immunoprecipitation ואחריו רצף, או ChIP-seq, היא טכניקה שניתן להשתמש בה כדי לגלות את המטרות הרגולטוריות של גורמי שעתוק, שינויים histone, וחלבונים אחרים הקשורים ל- DNA. ב- ChIP-seq, תאים נקצרים וחלבון מחייב DNA. מקושר לדנ"א בוויו עם פורמלדהיד.
תאים הם lysed, שחרור תוכן התא כרומטין הוא ניתב לרסיסים של פחות מ 1000 זוגות בסיס, בדרך כלל בין 200 ו 600 זוגות בסיס. DNA, אינטראקציה עם חלבון היעד, הוא immunoprecipitated באמצעות נוגדנים מבודד על ידי דה crosslinking. הצלבות חלבון DNA הפוכות ו- RNA וחלבון מתעכלים.
הדנ"א מטוהר, הופך לספריות, ורצף. ניתן להשתמש בנתונים של ChIP-seq גם כדי למצוא איגוד דיפרנציאלי של גורמי שעתוק בתנאים סביבתיים שונים או בסוגי תאים שונים. בתחילה, ChIP בוצע באמצעות הכלאה על microarray.
עם זאת, רצף ChIP הפך לשיטה המועדפת בשל ההתקדמות הטכנולוגית, הפחתת חסמים פיננסיים לתהפוכות ותפוקת נתונים מסיבית באיכות גבוהה. בפרוטוקול זה, נדגים טכניקות של ביצוע ChIP-seq עם ביופילמים חיידקיים, מקור עיקרי של זיהומים מתמשכים וכרוניים. ChIP-seq תבוצע על ביופילם טיפימוריום סלמונלה ותאים פלנקטוניים, מיקוד הרגולטור הביופילם הראשי, CSGD, כדי לקבוע כריכה דיפרנציאלית בשני סוגי התאים.
בסרטון זה, נדגים טכניקות של קביעת הכמות המתאימה של ביופילם לקציר, נרמול לדגימה בקרה פלנקטונית, הומוגניזציה של ביופילם לגישה לצלב וביצוע שלבי ChIP-seq שגרתיים כדי להשיג תוצאות רצף באיכות גבוהה. צלחת פס סלמונלה enterica לשרת טיפימוריום שלנו על צלחת אגר LB לבודד מושבות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לחסן חמישה מרק LB mL עם אחד עד שלוש מושבות מצלחת פס דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד במשך שבע שעות או לרשום צמיחה.
מצא את הצפיפות האופטית של תרבות הבקבוק ב 600 ננומטר, באמצעות ספקטרופוטומטר ולהוסיף OD אחד 600 שווה ערך של תאים או 10 לתשעה תאים לבקבוק Erlenmeyer המכיל 100 מיליליטר של אחד אחוז טריפטון. דגירה ב 28 מעלות צלזיוס עם רעידות במשך 13 שעות. תאי ביופילם מופיעים כפתיתים מצטברים ותאים פלנקטוניים בודדים נמצאים במדיה המעוננת.
ביופילם עמידים מאוד ונצמדים לצדדים של צינורות וטיפים פיפטה. אנו משתמשים במדיה מותנה כדי להזיז ביופילם בתחילה ולהשתמש PBS חם מיד לפני crosslinking כדי להסיר חלבון crosslinking מצעים בתקשורת. ייתכן שהחוקרים יצטרכו למצוא פתרון מתאים כדי להשעות מחדש את הביופילם.
לאסוף את תרבות הבקבוק בצינור צנטריפוגה צנטריפוגה ב 12, 000 G במשך 10 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. דקאנטנט לתוך יחידת סינון 0.2 מיקרומטר ומסנן ואקום. תרבות בקבוקון Aliquot לתוך צינורות צנטריפוגה במהירות איטית להפריד בין שני סוגי התאים.
תאי ביופילם נמצאים גלולה בחלק התחתון של הצינור ותאים בודדים הם על טבעי מעונן. פיפטה העל-טבעי המכיל תאים פלנקטוניים לתוך צינור צנטריפוגה לאחר כך. 25 מיקרוגרם של דנ"א מומלץ כקלט לניסויי ChIP-seq.
במקרה שלנו, 30 מיליגרם של ביופילם מניבים כ-25 מיקרוגרם דנ"א. מאז אגרגטים biofilm יש שפע של חומר חוץ תאי חלבוני, הוא מתחרה על crosslinker עלול לגרום מוצר מקושרים לא שווים שהוצגו עבור immunoprecipitation. הצעת אסאי חלבונים לקביעת חומר תאים שווה ערך לפי ריכוז חלבונים מוצעת.
במקרה זה, שישה תאים פלנקטוניים OD 600 נקצרים כפקד עבור 30 מיליגרם של ביופילם. ביופילם נקצר על ידי משקל רטוב ואת המושבה יחידות חקלאות של ביופילם ניתן למצוא באמצעות גורם ההמרה המוצג. החוקרים מעודדים למצוא את גורם ההמרה של המין יוצר ביופילם הם עובדים עם על ידי הומוגניזציה ודילול טיפה.
להשעות מחדש את גלולת biofilm במיליליטר אחד של טריפטון מותנה ולעבור לתוך כובע הצמדה שני מיליליטר שקל מראש או צינור כובע בורג. צנטריפוגה לדקה אחת ב 11, 000 G. להסיר את העל טבעי מהצינור ולשקול את הצינור במדויק. הפחת את משקל הצינור ממשקל הצינור עם ביופילם כדי למצוא את המשקל של אגרגטים.
זה צריך להיות בטווח של 10% ממשקל הביופילם של המטרה. הוסף מיליליטר אחד של PBS ומערבולת כדי להשעות מחדש אגרגטים ביופילם. מחלקים את העל-טבעי מצנטריפוגה במהירות איטית לצינורות צנטריפוגה.
למדוד את הצפיפות האופטית של התאים פלנקטוניים ב 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר ולחשב את הנפח הנדרש עבור OD הסופי 600 של שישה. מצננים את הצנטריפוגה של פלורה ל-10 מעלות ומורידים את התאים הפלנקטוניים בעזרת הצנטריפוגה של פלורה. צנטריפוגה ב 10, 000 G במשך 10 דקות ב 10 מעלות צלזיוס.
הסר את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת הכדור ב- PBS. Remeasure OD 600 של התאים פלנקטוני באמצעות ספקטרופוטומטר ולחלק את הנפח של שישה OD 600 תאים פלנקטוניים לתוך כובע הצמד שני מיליליטר או צינור כובע בורג. יש לפרק צבירות ביופילם כדי לאפשר ל-crosslinker לגשת לתאים.
תאים פלנקטוניים מטופלים באותו אופן כמו תאי ביופילם כדי להפחית משתנים. שימוש חרוזים מתכת במפעל מערבל עשוי להיות יעיל יותר עבור פירוק ביופילם מאשר homogenizers רקמת זכוכית. באופן בלתי מתאים, מוסיפים חרוז מתכת מעקר אחד לכל אחד מהצינורות.
הומוגניזציה באמצעות טחנת מיקסר במשך חמש דקות ב30 הרץ. שים לב צינורות צבירה כדי לאשר כי הביופילם נשבר לגזרים לפני העברת תאים הומוגניים לצינור חדש 1.5 מיליליטר, הימנעות חרוז מתכת. הבא את עוצמת הקול למיליליטר אחד עם PBS.
בשלב זה, זה אופציונלי לבצע דילול טיפה כדי למנות תאי קלט. לוותר פורמלדהיד טרי לתוך צינורות מדגם לריכוז סופי של אחוז אחד. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב.
מוסיפים גליצין לריכוז סופי של 125 מילימולרים כדי לרוות את הקישור הצולב ואת הדגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב. כדי לשטוף את התאים ולהסיר crosslinker עודף, צנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 8, 000 G ולהסיר את supernatant. להשעות מחדש את גלולה מעכבי פרוטאז ו 500 microliters של PBS מעוקר מסנן.
להשעות מחדש את גלולה ב 600 microliters של חיץ תזה דגירה על קרח במשך 10 דקות. העבר את ה- lysate החלקי לצינור חדש המכיל 1.4 מיליליטר של מאגר דילול IP. שמור על קרח במשך שעה וחצי עד שעתיים ומערבולת מדי פעם.
חומר עמיד כלשהו עשוי להישאר בצינורות. עם זאת, תקופת דגירה ארוכה ומערבולת מזדמנת יתפרקו חומר מצטבר והשאר יישבר במהלך sonication. כוונן את הקוליטור.
מניחים את הצינור 15 מיליליטר בפקעת קרח וממקם את החללית בתוך הצינור. דופק ב 20 עד 40 אחוזים במשך חמישה פרצי sonication של 30 שניות וקריר בין סיבובי sonication. ליסוס התא ייראה מעונן לפני sonication ו ייראה ברור לאחר sonication.
כדי להסיר חומר זירז, צנטריפוגה ב 8, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות ולחלק את supernatant לתוך צינור חדש, הימנעות גלולה שחורה. העברת אנרגיה Sonicator ועמידות לסוג התא עשויים להיות שונים ולכן אסיעת sonication מומלץ למצוא את מספר סיבובי sonication כי יפיק את טווח גודל שבר הנדרש להכנת ספרייה במורד הזרם רצף. מחלקים דנ"א קולי ל-1.35 מיליליטר לאליקוט אחד לכשל חיסוני ו-200 מיקרוליטר כדנ"א קלט.
שמור על בקרת הקלט במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוק הצלבות וצעדי עיכול. לאחר בדיקת הנוגדנים כדי להבטיח את הספציפיות שלהם לחלבון היעד, מוסיפים את הנוגדן לצינורות immunoprecipitation ודגירה בארבע מעלות צלזיוס לילה על גלגל מסתובב. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של חלבון G חרוזים מגנטיים דגירה בארבע מעלות צלזיוס על גלגל מסתובב במשך שלוש שעות.
לקשור את חרוזים לצדדים של צינורות באמצעות מעמד מגנטי ולבצע שטיפות. לשטוף פעמיים עם 750 microliters של מאגר שטיפת IP קר אחד. לשטוף אחד עם 750 microliters של מאגר שטיפת IP קר 2.
ולשטוף פעמיים עם 750 microliters של TE קר ב pH שמונה. שמור את הצינורות על הדוכן המגנטי במהלך הכביסה. הוסיפו 450 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון IP לכל צינור ודגירה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם מערבולות עדינות כל חמש דקות.
לקשור את חרוזים לצדדים של צינורות באמצעות מעמד מגנטי. המתן לפחות שתי דקות עד שהפתרון יתפנה ולאחר מכן לוותר על הפתרון פינה צינור חדש 1.5 מיליליטר. כדי להפוך crosslinks ולעכל RNA, להוסיף שני מיקרוגרם של RNase שמונה ולהוסיף נתרן כלורי לריכוז הסופי של 0.3 טוחן בכל צינור.
דגירה ב 65 מעלות צלזיוס במשך יותר משש שעות או לילה. לעיכול חלבון, יש להוסיף 180 מיקרוגרם חלבון K לכל צינור ותצנרר ב-45 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש שעות. לטהר את ה-DNA.
חרוזים מגנטיים עדיפים על בידוד כמויות קטנות של DNA התאושש במהלך ChIP עם תאים חיידקיים. עם זאת, החילוץ מבוסס עמודה או phenylchloroform עשוי לשחזר כראוי DNA ChIP. לאחר הטיהור, ספריות מוכנות מדנ"א מטוהר של ChIP באמצעות ערכה התואמת לפלטפורמת הרצף שנבחרה.
ספריות DNA של ChIP דורשות לעתים קרובות להוסיף את הכמות המינימלית של מתאמים ולבצע את המספר המרבי של מחזורי הגברה של PCR. בדוק את גודל הספרייה על ידי bioanalyzer ולבדוק את ריכוז הספרייה עם cubit או ערכת כימות ספריית QPCR. אסוף את הספריות והמשך ברצף בהתאם למפרט הפלטפורמה שנבחרה.
ניתוח נתוני ChIP-seq דורש ניקוד איכות הבסיס, קיצוץ בסיסים באיכות נמוכה, יישור הרכבה קורא לגנום התייחסות, קורא פסגות, שיוך פסגות עם גנים, וניתוח מוטיבים מחייבים מיוצגים יתר על המידה. נתוני ChIP-seq בדרך כלל יש רמה נמוכה של רקע. דנ"א הנשלט על ידי החלבון הממוקד על ידי immunoprecipitation יועשר ויופיע כפסגות שנמצאות לפחות פי שניים מעל הרקע.
בסרטון זה תיארנו שיטות לביצוע ChIP-seq על ביופילם סלמונלה ותאים פלנקטוניים בודדים המניב פסגות של דנ"א מועשר בגנים הנשלטים על ידי גורם התמלול של עניין. רוב החיים החיידקיים בטבע נחשב קיים ביופילמים עד 40% של מחלות אנושיות נחשבים ביופילם הקשורים. אז יש להם השפעות רפואיות וכלכליות עצומות.
עם זאת, biofilm הוא עמיד וקשה יותר למנות, לשבור פתוח, ולתפעל. חוקרים יכולים להשתמש בטכניקות ChIP-seq שתיארנו כדי לקצור כמות מתאימה של ביופילם, הומוגניזציה של הביופילם, תאי lyse, sonicate, לבצע immunoprecipitation, לטהר ורצף DNA ממין חיידקי יוצר ביופילם אחרים.
