クロマチン免疫沈降後にシーケンシング(ChIP-seq)は、転写因子、ヒストン修飾、および他のDNA関連タンパク質の調節標的を発見するために使用することができる技術です。ChIP-seqでは、細胞が採取され、DNA結合タンパク質が採取されます。インビボのDNAとホルムアルデヒドと交差する。
細胞は溶解され、細胞内容物およびクロマチンを放出し、1000塩基対未満の断片に、通常は200〜600塩基対の間に分離される。DNAは、標的タンパク質と相互作用し、抗体を用いて免疫沈降し、架橋解除により単離される。DNAタンパク質架橋は逆転し、RNAとタンパク質は消化されます。
DNAは精製され、ライブラリーに作られ、配列決定される。ChIP-seqデータは、異なる環境条件または細胞タイプにおける転写因子の差結合を見つけるためにも使用することができる。当初、ChIPはマイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行った。
しかし、技術の進歩、シーケンシングに対する財務上の障壁の減少、および大規模な高品質データ出力により、ChIPシーケンシングが好ましい方法となっています。このプロトコルでは、持続性および慢性感染の主要な原因である細菌バイオフィルムを用いてChIP-seqを行う技術を実証する。ChIP-seqは、サルモネラ菌のチフィムリウムバイオフィルムおよびプランクトン細胞に対して行われ、マスターバイオフィルムレギュレータCSGDを標的にして、2つの細胞タイプにおける差動結合を決定する。
本ビデオでは、収穫に適量のバイオフィルムを決定し、プランクニクス制御サンプルに正規化し、架橋用バイオフィルムを均質化し、定期的なChIP-seqステップを実行して高品質のシーケンシング結果を得る方法を紹介します。ストリークプレートサルモネラ腸炎は、コロニーを分離し、一晩摂氏37度でインキュベートするためにLB寒天プレートに私たちのチフィムリウムを提供します。ストリークプレートから1〜3コロニーで5 mL LBスープを接種し、7時間振るか、成長を記録して摂氏37度でインキュベートします。
分光光度計を用いて600ナノメートルのフラスコ培養の光学密度を見つけ、100ミリリットルのトリプトンを含むエルレンマイヤーフラスコに細胞培養に相当する1つのOD 600または9個の細胞に10を加える。13時間揺れで摂氏28度でインキュベートします。バイオフィルム細胞は凝集フレークとして現れ、単一のプランクトニック細胞は曇った媒体にある。
バイオフィルムは非常に抵抗力があり、管およびピペットの先端の側面に付着する。初期設定では、調整された培地を使用してバイオフィルムを移動し、架橋の直前に温かいPBSを使用して、メディア内のタンパク質架橋基質を除去します。研究者は、バイオフィルムを再中断するための適切な解決策を見つける必要があります。
12,000 Gの遠心分離管と遠心分離機にフラスコ文化を摂氏10度で10分間収集します。上清を0.2マイクロメートルのフィルターユニットと真空フィルターにデカントします。アリコートフラスコは、2つの細胞タイプを分離するために遅い速度でチューブと遠心分離機に培養します。
バイオフィルム細胞は、チューブの底部のペレットにあり、単一細胞は曇りの上清にある。後で遠心分離チューブにプランクトン細胞を含む上清をピペット。25マイクログラムのDNAは、ChIP-seq実験の入力として推奨されます。
我々の場合、バイオフィルムの30ミリグラムは約25マイクログラムのDNAを生み出す。バイオフィルム凝集体はタンパク質性細胞外物質が豊富であるため、架橋剤を競い合い、免疫沈降に対して提示される不均一な架橋産物を生じる可能性があります。タンパク質濃度によって等価細胞物質を決定するタンパク質アッセイが示唆される。
この場合、6個のOD 600プランクトニック細胞が30ミリグラムのバイオフィルムのコントロールとして収穫される。バイオフィルムは、バイオフィルムの湿重量およびコロニー農業単位によって収穫され、図示された変換係数を用いて見つけることができる。研究者は、均質化およびドロップ希釈によって彼らが働くバイオフィルム形成種の変換因子を見つけることを奨励される。
バイオフィルムペレットを1ミリリットルのコンディショナリングトリプトンで再中断し、あらかじめ計量した2ミリリットルのスナップキャップまたはスクリューキャップチューブに移動します。11,000 G.11,000で1分間遠心分離機を取り出し、チューブを正確に計量します。バイオフィルムを使用してチューブの重量を差し引いて、凝集体の重量を見つけます。
標的バイオフィルム重量の10%以内であるべきである。1ミリリットルのPBSと渦を加え、バイオフィルム凝集体を再中断します。低速遠心分離から遠心分離管に上清を分配します。
分光光度計を用いて600ナノメートルでプランクトン細胞の光学密度を測定し、6の最終的なOD 600に必要な体積を計算します。フローラ遠心分離機を摂氏10度に冷却し、フローラ遠心分離機を使用してプランクトニック細胞をペレットにします。摂氏10度で10分間10,000Gの遠心分離機。
上清を取り除き、PBSでペレットを再び懸濁します。分光光度計を用いてプランクトン細胞のOD 600を再測定し、6個のOD 600プランクトンセルの体積を2ミリリットルのスナップキャップまたはスクリューキャップチューブに分配します。クロスリンカーが細胞にアクセスできるようにするには、バイオフィルムの凝集体を分解する必要があります。
プランクトニック細胞は、バイオフィルム細胞と同様に処理され、変数を減らします。ミキサーミルで金属ビーズを使用すると、ガラス組織ホモジナイザーよりもバイオフィルムを分解する方が効果的です。無菌で、各チューブに滅菌金属ビーズを1個加えます。
ミキサーミルを使用して、30ヘルツで5分間ホモジナイズします。凝集管を観察して、均質化された細胞を新しい1.5ミリリットルチューブに移す前に、バイオフィルムが分解されていることを確認し、金属ビーズを避けます。PBSで1ミリリットルにボリュームを持参してください。
この時点で、入力セルを列挙するためにドロップ希釈を行うことは任意である。新鮮なホルムアルデヒドをサンプルチューブに1%の最終濃度に分配します。回転ホイールで室温で30分間インキュベートします。
交差リンクをクエンチするために125ミリモルの最終濃度にグリシンを加え、回転ホイールの室温で5分間インキュベートします。細胞を洗浄し、過剰な架橋剤を除去するために、遠心分離機を8,000Gで3分間、上清を除去する。プロテアーゼ阻害剤中のペレットを再懸濁し、500マイクロリットルのフィルター滅菌PBSを再中断する。
600マイクロリットルのリシスバッファーにペレットを再懸濁し、氷の上で10分間インキュベートします。IP希釈バッファーの1.4ミリリットルを含む新しいチューブに部分溶解物を移動します。氷の上に1時間半から2時間、渦を時々保ちます。
いくつかの耐性材料は、チューブに残る可能性があります。しかし、長い潜伏期間と時折渦は凝集された材料を分解し、残りは超音波処理中に壊れます。超音波処理器を調整します。
15ミリリットルのチューブを氷のビーカーに入れ、プローブをチューブの中に入れる。30秒の5音波バーストのための20〜40パーセントでパルスと超音波ラウンドの間にクール。細胞のライセートは超音波処理の前に曇って表示され、超音波処理後に明確に表示されます。
沈殿物を除去するために、8,000Gで遠心分離機を4度で10分間、上澄み物を新しいチューブに分配し、黒ペレットを避ける。超音波処理器のエネルギー伝達とセルタイプの抵抗は異なるので、超音波処理アッセイは、下流のライブラリの準備とシーケンシングに必要なフラグメントサイズ範囲を生成する超音波処理ラウンドの数を見つけることをお勧めします。超音波処理されたDNAを免疫沈降のための1.35ミリリットルのアリコートに、そして1つの200マイクロリットルアリコートを入力DNAとして分配する。
入力制御は、リンク解除と消化のステップまでマイナス80°Cに保ちます。抗体をテストして標的タンパク質の特異性を確認した後、抗体を免疫沈降管に加え、回転ホイールで一晩摂氏4度でインキュベートします。50マイクロリットルのプロテインG磁気ビーズを加え、回転ホイールで摂氏4度で3時間インキュベートします。
磁気スタンドを使用してビーズをチューブの側面に結合し、ワッシュを行います。750マイクロリットルのコールドIP洗浄バッファー1つで2回洗浄します。750マイクロリットルのコールドIP洗浄バッファー2つで1つを洗浄します。
そして、pH 8で750マイクロリットルの冷たいTEで2回洗います。くすいの間は、磁気スタンドにチューブを置いてください。各チューブに450マイクロリットルのIP溶出バッファーを加え、5分ごとに穏やかな渦で30分間摂氏65度でインキュベートします。
磁気スタンドを使用して、ビーズをチューブの側面にバインドします。溶液が透明になるまで少なくとも2分間待ってから、クリアした溶液を新しい1.5ミリリットルチューブに分配します。クロスリンクを逆にしてRNAを消化するには、RNase 8の2マイクログラムを追加し、各チューブの0.3モルの最終濃度に塩化ナトリウムを加えます。
摂氏65度で6時間以上または一晩インキュベートします。タンパク質を消化するには、各チューブに180マイクログラムのプロテイナーゼKを加え、摂氏45度で3~5時間インキュベートします。DNAを浄化する。
磁気ビーズは、細菌細胞とのChIP中に回収された少量のDNAを単離するために好ましい。しかしながら、カラムベースまたはフェニルクロロホルム抽出は、ChIP DNAを適切に回収し得る。精製後、ライブラリは、選択されたシーケンシングプラットフォームと互換性のあるキットを使用して、精製されたChIP DNAから調製されます。
ChIP DNAライブラリでは、多くの場合、最小量のアダプターを追加し、PCR増幅サイクルの最大数を実行する必要があります。バイオアナライザでライブラリのサイズを確認し、キュービットまたはQPCRライブラリ定量キットでライブラリの濃度を確認します。ライブラリをプールし、選択したプラットフォームの仕様に従ってシーケンス処理を続行します。
ChIP-seqデータの分析では、基本品質のスコアリング、低品質の塩基のトリミング、アセンブリ読み取り値の参照ゲノムへの位置合わせ、ピークの呼び出し、ピークと遺伝子の関連付け、過剰に表現された結合モチーフの分析が必要です。ChIP-seq データは、通常、バックグラウンドレベルが低い。免疫沈降によって標的となるタンパク質によって制御されるDNAは濃縮され、少なくとも2倍上の背景であるピークとして現れます。
本ビデオでは、サルモネラバイオフィルムおよび単一プランクトン細胞に対してChIP-seqを行う方法について説明しました。自然界の細菌の生命の大半はバイオフィルムに存在すると考えられているし、人間の病気の最大40%はバイオフィルム関連であると考えられている。だから、彼らは巨大な医学的および経済的影響を持っています。
しかし、バイオフィルムは抵抗力があり、列挙、開いた破壊、および操作が困難です。研究者は、我々が説明したChIP-seq技術を使用して、適切な量のバイオフィルムを収穫し、バイオフィルム、ライゼ細胞、超音波処理、免疫沈降、精製および配列DNAを他のバイオフィルム形成細菌種から行うことができます。
