크로마틴 면역침전 및 고처리량 시퀀싱(ChIP-seq)을 이용한 살모넬라 바이오필름의 CsgD 규제 목표 발견

염색체 면역 침전물 다음에 시퀀싱, 또는 ChIP-seq, 전사 요인, 히스톤 수정 및 기타 DNA 관련 단백질의 규제 목표를 발견하는 데 사용할 수있는 기술이다. ChIP-seq에서 세포는 수확되고 DNA 결합 단백질. 포름알데히드와 생체 내 DNA에 교차 연결됩니다.

세포는 감하, 세포 내용물 및 크로마틴을 방출하는 것은 보통 200및 600개의 염기 쌍 사이, 1000미만의 염기 쌍의 단편으로 전염된다. 표적 단백질과 상호 작용하는 DNA는 항체를 사용하여 면역 전염되고 교차 해제에 의해 분리된다. DNA 단백질 크로스링크는 반전되고 RNA와 단백질은 소화됩니다.

DNA는 정제되고, 라이브러리로 만들어지고, 순서화됩니다. ChIP-seq 데이터는 또한 다른 환경 조건 또는 세포 모형에 있는 전사 인자의 차동 결합을 찾아는 것을 이용될 수 있습니다. 처음에 ChIP는 마이크로어레이에서 혼성화를 통해 수행되었습니다.

그러나 ChIP-시퀀싱은 기술 발전, 시퀀싱에 대한 재정적 장벽 감소, 대규모 고품질 데이터 출력으로 인해 선호하는 방법이 되었습니다. 이 프로토콜에서는 지속적이고 만성 감염의 주요 원인인 세균성 생물막으로 ChIP-seq를 수행하는 기술을 시연할 것입니다. ChIP-seq는 두 세포 유형에서 차동 결합을 결정하기 위해 마스터 바이오필름 레귤레이터 인 CSGD를 대상으로 살모넬라 타이피무륨 생물막 및 판자 세포에서 수행됩니다.

이 비디오에서는 수확할 적절한 양의 바이오필름을 결정하고, 판자 제어 시료로 정상화하고, 크로스링커 접근을 위한 생체막을 균질화하고, 고품질 시퀀싱 결과를 얻기 위한 일상적인 ChIP-seq 단계를 수행하는 기술을 시연할 것입니다. 줄무늬 플레이트 살모넬라 엔테리카는 LB 천접시에 타이피무륨을 제공하여 식민지를 분리하고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양합니다. 5mL LB 국물을 줄무늬 플레이트에서 1~3개의 콜로니를 접종하고 섭씨 37도에서 7시간 동안 흔들리거나 성장을 기록합니다.

600 나노미터에서 플라스크 배양의 광학 밀도를 찾아, 분광계를 사용하여 1개의 OD 600 동등한 세포 배양 또는 10을 9개의 세포에 10%의 트라이프톤 100 밀리리터를 포함하는 Erlenmeyer 플라스크에 추가합니다. 섭씨 28도에서 13시간 동안 흔들리면 배양하세요. 생물막 세포는 응집된 플레이크로 나타나고 단일 판자 세포는 흐린 매체에 있습니다.

바이오필름은 매우 저항력이 뛰어나며 튜브와 파이펫 팁의 측면에 충실합니다. 우리는 처음에 생물막을 이동하고 매체에서 단백질 교차 연결 기판을 제거하기 위해 교차 연결 직전에 따뜻한 PBS를 사용하기 위해 조건부 미디어를 사용합니다. 연구원은 생물막을 다시 중단하기 위하여 적당한 해결책을 찾아야 할 지도 모릅니다.

원심분리기 튜브와 원심분리기에서 12, 000G에서 10°C에서 10분간 플라스크 문화를 수집합니다. 상체를 0.2 마이크로미터 필터 장치 및 진공 필터로 데칭합니다. Aliquot 플라스크 배양튜브와 원심분리기는 느린 속도로 두 세포 유형을 분리합니다.

생물막 세포는 튜브의 바닥에 펠릿에 단일 세포는 흐린 상체에 있습니다. 나중에 원심분리기 튜브에 판자 세포를 포함하는 상체 피펫. 25 마이크로그램의 DNA는 ChIP-seq 실험에 대한 입력으로 권장됩니다.

우리의 경우, 생물막의 30 밀리그램은 DNA의 약 25 마이크로 그램을 산출합니다. 생물막 응집체는 단백질 세포 외 물질의 풍부를 가지고 있기 때문에, 그것은 크로스 링커경쟁하고 면역 침전을 위해 제시 된 불평등 교차 연결 생성을 초래할 수 있습니다. 단백질 농도에 의해 동등한 세포 물질을 결정하는 단백질 분석이 제안된다.

이 경우 6개의 OD 600 판자 세포가 30밀리그램의 생물막을 대조하기 위해 수확됩니다. 바이오필름은 젖은 중량에 의해 수확되고 생물막의 식민지 농업 단위는 표시된 변환 계수를 사용하여 발견될 수 있다. 연구원은 균질화에 의해 작업 하는 생물 막 형성 종의 변환 요인을 찾아 내고 희석을 드롭 하는 것이 좋습니다.

조건부 트립톤의 1 밀리리터에서 생물막 펠릿을 다시 중단하고 미리 계량된 2밀리리터 스냅 캡 또는 나사 캡 튜브로 이동합니다. 원심분리기는 11, 000 G.에서 1분 동안 튜브에서 상퍼를 제거하고 튜브의 무게를 정확하게 측정합니다. 골재의 무게를 찾기 위해 생체 필름으로 튜브의 무게에서 튜브 무게를 빼냅니다.

대상 바이오필름 중량의 10% 이내여야 합니다. 생물막 응고를 다시 중단하기 위해 PBS와 소용돌이1 밀리리터를 추가합니다. 느린 속도 원심분리기에서 원심분리관으로 상피체를 분배합니다.

분광광계를 사용하여 600 나노미터에서 판자 세포의 광학 밀도를 측정하고 6의 최종 OD 600에 필요한 부피를 계산합니다. 플로라 원심분리기를 섭씨 10도로 식히고 플로라 원심분리기를 사용하여 판자 세포를 펠릿으로 냉각시하십시오. 10, 000 G의 원심분리기는 섭씨 10도에서 10분 동안.

상체를 제거하고 PBS에서 펠릿을 다시 중단합니다. 분광계를 사용하여 판자 세포의 OD 600을 재측정하고 6개의 OD 600 판자 세포의 부피를 2밀리리터 스냅 캡 또는 스크류 캡 튜브로 분배한다. 크로스링커가 세포에 접근할 수 있도록 생물막 응집체가 분해되어야 합니다.

플랑크토닉 세포는 변수를 줄이기 위해 생물막 세포와 동일한 방식으로 처리됩니다. 믹서 밀에 금속 구슬을 사용하면 유리 조직 균질화보다 생물 막을 분해하는 데 더 효과적일 수 있습니다. 무균, 각 튜브에 하나의 멸균 금속 비드를 추가합니다.

30 헤르츠에서 5 분 동안 믹서 밀을 사용하여 균질화하십시오. 골재관을 관찰하여 균질화된 세포를 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 이송하기 전에 생물막이 분리되었는지 확인하여 금속 비드를 피한다. PBS로 볼륨을 1 밀리리터로 가져옵니다.

이 시점에서 입력 셀을 예매하기 위해 낙하 희석을 수행하는 것이 선택 사항입니다. 신선한 포름알데히드를 샘플 튜브에 분배하여 최종 농도를 1%로 분배합니다. 회전 하는 바퀴에 실온에서 30 분 동안 배양.

글리신을 125 밀리몰러의 최종 농도에 추가하여 교차 연결을 담금질하고 회전 하는 바퀴의 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 세포를 세척하고 여분의 크로스 링커를 제거하기 위해, 8, 000 G에서 3 분 동안 원심 분리기를 제거하고 상체를 제거합니다. 프로테아제 억제제와 500 마이크로리터의 살균 된 PBS에서 펠릿을 다시 중단합니다.

600 마이크로리터의 리시스 버퍼로 펠릿을 다시 중단하고 10분 동안 얼음에 배양합니다. 부분 용하를 IP 희석 버퍼 1.4 밀리리터를 포함하는 새 튜브로 이동합니다. 1~2시간 동안 얼음을 유지하고 가끔 은은하게 소용돌이를 치십시오.

일부 내성 물질은 튜브에 남아있을 수 있습니다. 그러나, 긴 잠복기와 가끔 소용돌이는 집계 된 물질을 분해하고 나머지는 초음파 처리 중에 부서질 것입니다. 초음파 처리기 조정.

15 밀리리터 튜브를 얼음 비커에 놓고 프로브를 튜브 내부에 놓습니다. 30초 동안 5개의 초음파 처리 버스트에 대해 20~40%의 펄스를 하고 초음파 처리 라운드 사이에 시원하게 처리합니다. 셀 리세이트 초음파 처리 전에 흐린 표시되며 초음파 처리 후 명확하게 나타납니다.

침전 된 물질을 제거하기 위해, 원심분리기는 8, 000 G에서 4도에서 10 분 동안, 검은 펠릿을 피하면서 새로운 튜브에 상류체를 분배합니다. 초음파 에너지 전달 및 세포 형 저항이 다를 수 있으므로 초음파 처리 분석은 다운스트림 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 필요한 단편 크기 범위를 생성하는 초음파 처리 라운드의 수를 찾는 것이 좋습니다. 면역 침전을 위한 1.35 밀리리터 알리쿼트에 초음파 처리된 DNA를 분배하고 입력 DNA로 200 마이크로리터 알리쿼트 1개를 분배합니다.

교차 연결 및 소화 단계가 될 때까지 입력 컨트롤을 섭씨 80도에서 유지합니다. 표적 단백질에 대한 특이성을 보장하기 위해 항체를 테스트한 후, 면역 침전 튜브에 항체를 추가하고 회전 휠에서 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양한다. 단백질 G 마그네틱 구슬 50마이크로리터를 회전 휠에 섭씨 4도에 넣고 3시간 동안 배양합니다.

구슬을 자기 스탠드를 사용하여 튜브 의 측면에 바인딩하고 세서히를 수행합니다. 차가운 IP 세척 버퍼 1 750 마이크로 리터로 두 번 세척하십시오. 차가운 IP 세척 버퍼 2750 마이크로 리터로 씻어.

그리고 pH 8에서 750 마이크로 리터의 차가운 TE로 두 번 씻으십됩니다. 세차하는 동안 자기 스탠드에 튜브를 유지합니다. 각 튜브에 450 마이크로리터의 IP 용출 버퍼를 추가하고 5 분마다 부드러운 소용돌이로 30 분 동안 섭씨 65도에서 배양하십시오.

마그네틱 스탠드를 사용하여 구슬을 튜브 측면에 묶습니다. 용액이 명확해질 때까지 적어도 2분 정도 기다린 다음 클리어된 솔루션을 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 분배합니다. 크로스링크를 반전시키고 RNA를 소화하려면 RNase 8의 2마이크로그램을 추가하고 각 튜브에 0.3 개의 어금니의 최종 농도에 염화 나트륨을 추가하십시오.

6시간 이상 또는 하룻밤 동안 섭씨 65도에서 배양하십시오. 단백질을 소화하려면 각 튜브에 180 마이크로그램의 단백질아제 K를 추가하고 섭씨 45도에서 3~5시간 동안 배양합니다. DNA를 정화합니다.

마그네틱 구슬은 세균세포로 ChIP 동안 회수된 소량의 DNA를 격리하는 것이 바람직하다. 그러나, 컬럼 기반 또는 페닐클로로폼 추출은 ChIP DNA를 적절히 복구할 수 있다. 정제 후, 라이브러리는 선택한 시퀀싱 플랫폼과 호환되는 키트를 사용하여 정제된 ChIP DNA로부터 제조된다.

ChIP DNA 라이브러리는 종종 최소 량의 어댑터를 추가하고 최대 PCR 증폭 주기를 수행해야 합니다. 생체 분석기로 라이브러리 크기를 확인하고 큐빗 또는 QPCR 라이브러리 정량화 키트로 라이브러리 농도를 확인합니다. 라이브러리를 풀링하고 선택한 플랫폼의 사양에 따라 시퀀싱을 진행합니다.

ChIP-seq 데이터의 분석은 기본 품질을 채점하고, 저품질 베이스를 트리밍하고, 어셈블리 판독을 참조 게놈에 정렬하고, 피크를 호출하고, 피크를 유전자와 연결시키고, 과대 대표결합 모티프를 분석해야 합니다. ChIP-seq 데이터는 일반적으로 낮은 수준의 배경을 가지고 있습니다. 면역 침전증에 의해 표적으로 한 단백질에 의해 통제되는 DNA는 풍부하게 될 것이고 배경 위에 적어도 2 배 인 봉우리로 나타날 것입니다.

이 비디오에서는, 우리는 관심의 전사 인자에 의해 통제된 유전자에 농축된 DNA의 피크를 산출하는 살모넬라 생물막 및 단 하나 판자 세포에 ChIP-seq를 능력을 발휘하는 방법을 기술했습니다. 자연에서 세균 생명의 대다수는 생물막에 존재하기 위하여 생각하고 인간 적인 질병의 최대 40%는 생물막 관련인 것으로 생각됩니다. 그래서 그들은 엄청난 의료 및 경제적 영향을 미칩니다.

그러나 생물막은 내성이 뛰어나고 열거되고, 열고, 조작하기가 더 어렵습니다. 연구원은 우리가 생체 필름의 적당한 양을 수확하고, 생물막을 균질화하고, 세포, 초음파 처리, 면역 침전을 능력을 발휘하고, 다른 생물막 형성 세균성 종에서 DNA를 정화하고 서열하기 위하여 우리가 기술한 ChIP-seq 기술을 사용할 수 있습니다.