Наш протокол обеспечивает и простой и быстрый подход для первичной изоляции фибробластов с четким акцентом на предотвращение загрязнения бактериями, которые могут быть огромной проблемой. Особенно для начинающих. Основным преимуществом нашей техники является ее простота.
Поскольку это не требует обширных ручных навыков или опыта, и это может быть легко изучены всеми в течение короткого периода обучения. Представляя технику будет Manja Newe, техник из лаборатории. Перед началом вскрытия на надеть две пары одноразовых перчаток, одна поверх другой.
И починьте мышь на полистироловой площадке. Дезинфицировать мех 70% этанола, убедившись, что животное пропитано. И использовать этанол стерилизованных хирургических типсов и атрауматических ножниц для чашки кожи прямо над урогенитального тракта.
Вырезать три-четыре сантиметра вдоль средней линии от первоначального разреза на шею, добавив рельефа сокращений на конечностях. И прикрепите кожу к колодке для достижения оптимального доступа к мускулатуре, покрывающей брюшную полость. Затем дважды дезинфицировать брюшную мускулатуру свежим 70%этанолом.
Когда этанол высохнет, удалите первую пару перчаток. И использовать новый стерильный набор типсов и ножниц, чтобы наклонить мышечный слой, чтобы открыть брюшную полость и грудную клетку. Чтобы удалить органы, представляющие интерес, аккуратно схватить каждый орган с хирургическими типсами без пирсинга ткани.
И используйте ножницы, чтобы тщательно сократить поставки кровеносных сосудов вблизи точки входа органа. Поместите каждый орган в трубку стерильной, холодной PBS и плотно закройте трубку. Размещение каждой трубки на мокром льду, как органы собираются.
Когда все органы были собраны, спрей трубки с 70%этанола, прежде чем поместить их в стерильные клетки культуры капюшон. Надев свежую пару перчаток, используйте стерильные типсы для переноса каждого органа на половину стерильной шестиметровой чашки Петри. И кратко мыть органы со свежим PBS, чтобы удалить избыток крови.
Перенесите промытые органы на вторую половину каждой чашки Петри и удалите излишки PBS. Используя два стерильных скальпеля, измельчите органы на фрагменты от одного до двух миллиметров. И использовать стерильный шпатель для передачи частей ткани в новые, индивидуальные, стерильные, 15 миллилитров труб.
Добавьте два миллилитров 0,25%трипсина раствор для каждой трубки. И поместите трубки в инкубатор клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. В конце инкубации вихревые трубы со скоростью около 1400 оборотов в минуту в течение десяти секунд.
И остановить реакцию трипсина с четырьмя миллилитров соответствующей культуры среды дополняется фетальной сыворотки теленка на трубку. Затем добавьте соответствующий объем раствора смеси коллагеназы в каждую трубку. И поместите трубки в 37 градусов по Цельсию ультразвуковой водяной бане в течение 10 минут.
В конце звуковой, осторожно вихрь труб в течение 10 секунд. Перед размещением трубки обратно в ультразвуковой водяной бане в течение еще 10 минут. В конце второго звукового, вихрь труб еще 10 секунд.
И дезинфицировать трубки с 70%этанола. В капюшоне клеточной культуры фильтруем подвески клетки через отдельные 40 микрометровые ситечко в новую стерильную 15-миллилитровую трубку. И собирать клетки путем центрифугации.
Повторно приостанавливайте гранулы в один миллилитр свежей среды на трубку. И увидеть клетки в подходящих сосудах культуры клеток при соответствующей плотности покрытия. Затем поместите клетки в инкубатор клеточной культуры на ночь.
На следующее утро, мыть каждую культуру три раза с PBS, прежде чем добавить свежие среды и возвращения клеток в инкубатор. Используя этот протокол, жизнеспособные фибробласты могут быть получены для использования в последующих экспериментах. Такие, как амино-флуоресцентные окрашивания или пролиферации экспериментов.
Взрослые фибробласты плоские, шпиндель формы клеток с несколькими клеточными процессами, которые обычно растут в монослой. Различные морфологические различия в популяциях фибробластов из разных органов можно наблюдать, однако. Например, почечные фибробласты меньше и растут при более высокой плотности, чем сердечные, легочные или печеночными фибробластами.
Изолированные фибробласты отображают высокие показатели распространения, достигая оптического слияния более чем на 90% примерно через шесть дней. Здесь, дифференцированный миофибробласт с отличительной альфа гладкой мышцы актин микрофиламентов можно наблюдать. Эти клетки находятся в изобилии в сердце, почках, печени и легких клеточных культур.
Хотя только около 20 до 30 процентов изолированных и культурных клеток выразить упорядоченно, расположены, альфа гладкой мышцы актин микрофильтры, практически все клетки являются положительными для Vimentin и Discoidin домена Рецептор 2 после семи дней в культуре. Самое главное помнить, чтобы использовать правильную технику на протяжении всей процедуры, как бактерии загрязнения следует избегать. После первичной изоляции фибробластов, клетки могут быть использованы для всех видов психиатрических экспериментов и характеристик.
Такие как иммуноцитатическая химия распространения или раны исцеления эссе, или молекулярно-биологических оценок.
