Стреляйте апические меристемы контролировать рост растений и воспроизводства. Этот метод помогает исследовать морфологию и внутренние структуры стрелять аперистами не только в модели видов, но и в различных культурах. Этот метод является очень эффективной процедурой.
Стрелять апикал меристем может быть непосредственно визуализированы в высоком клеточном разрешении без каких-либо трудоемких фиксации образца и ткани раздельных шагов. Для начала выращиваем арабидопсис, помидоры и соевые растения, как описано в текстовом протоколе. Вырезать соцветия стрелять вершину из болтами растений Arabidopsis.
Держите базальную часть основного стебля и используйте типсы, чтобы удалить как можно больше старых цветочных органов из основного стебля. Продолжить удаление остальных цветов в области стерео микроскопа до стрелять апический меристем можно увидеть из окуляров. Чтобы просмотреть вегетативные стрелять апические меристемы из помидоров или сои, вскрыть cotyledons, листья и корни из растения.
Держите гипокотилы растения под стерео микроскопом, и использовать миппы для дальнейшего вскрытия листьев и листьев primordia покрытие вегетативной стрелять апические меристемы. Pipette 50 микролитров раствора иодида пропидия в чистой и пустой чашке Петри. Dip весь вскрытый стрелять вершины в краситель в течение двух минут.
Во время процесса окрашивания, погрузить весь соцветия стрелять апический меристем или вегетативной стрелять апикал-меристем в раствор йодида пропидия для достижения равномерного окрашивания. Промыть окрашенные стрелять вершины дважды в стерильной, деионизированной воды. Теперь, проколоть отверстие в центре подготовленного изображения блюдо с помощью типсов, и придерживаться окрашенных стрелять вершины вертикально в среде.
Заполните изображение блюдо стерильной, деионизированной водой, чтобы полностью погрузить образец. Просмотр образца через стерео микроскоп. Pipette вверх и вниз, чтобы удалить пузырьки воздуха в ловушке вокруг меристемы.
Затем отрегулируйте угол стебля в агаре, чтобы убедиться, что стрелять апический меристем полностью виден прямо сверху. Теперь поместите изображение блюдо на стадии образца конфокального микроскопа. Опустите воду погружения объектив, и поднять стадию образца микроскопа, чтобы кончик объектива окунуться в воду.
Откройте программное обеспечение конфокального микроскопа, и использовать окуляры, чтобы найти и сосредоточиться на стрелять апический меристем в ярком поле. Работа функции приобретения в программном обеспечении конфокального микроскопа. Запустите режим в реальном времени, чтобы просмотреть образец с экрана компьютера, и настроить все параметры для эксперимента лазерного сканирования.
При настройке параметров используйте функцию Индикатора диапазона, чтобы определить, насыщен сигнал или нет. То же самое программное обеспечение, которое использовалось для получения изображений, может быть использовано для визуализации трехмерной прозрачной проекции. Откройте исходный конфокальный файл, нажмите 3D меню и выберите Прозрачный для создания 3D-проекционного представления.
Дополнительно выберите Transparency для настройки трех параметров проекции, включая Порог, Рамп и Максимум для прозрачности 3D-изображения. Теперь выберите Light, чтобы настроить яркость 3D-изображения. Экспорт прогнозируемых изображений, и сохранить их в качестве файлов TIFF.
Для визуализации изображения глубины кодирования 3D-изображений используйте одно и то же программное обеспечение. Опять же, нажмите 3D меню, и выберите внешний вид. Выберите Специальное и выберите кодирование глубины.
Экспорт прогнозируемых изображений, и сохранить их в качестве файлов TIFF. Это изображение из ортогональной секции через середину Arabidopsis стрелять апический меристем показывает, что горизонтальные стены окрашены иодидом пропидия почти во всех клетках в нескольких слоях клеток. Вид одного поперечного сечения через корпус соцветия стрелять апический меристем показывает, что клетки из плоскости XY также четко изображены.
Вид 3D-проекции показывает, что соцветие меристемы образует куполообразную структуру и окружено развивающейся цветочной имордией. Это изображение из ортогональной секции через середину томатной стрелять апикал меристем также показывает, что горизонтальные стены окрашены иодидом пропидия в нескольких слоях клеток, хотя сигнал опидия йодида из глубокой внутренней области немного ниже. Изображение из одного поперечного раздела через глубокие слои вегетативной стрелять апикал меристем показывает клетки из самолетов XY и границы, образовавшемся между вегетативной меристемы и листьев primordia.
3D проекционный вид может также обеспечить полное представление о форме и организации вегетативного меристема из помидора. Здесь показан ортогональный вид через середину сои стрелять апикал меристем и 3D проекции же стрелять апический меристем. Куполообразный вегетативный меристем и его производные новые листья приморья также заметны.
Propidium йодид может легко пятно поврежденных или мертвых клеток, которые будут в значительной степени влиять на качество изображений, поэтому важно, чтобы избежать каких-либо физических повреждений при подготовке стрелять apical meristem образцов.
