Наш протокол описывает использование обычных красителей BODIPY для микроскопии супер-разрешения, используя их редкие, красные сдвинутые состояния. Это позволяет изучать органеллы и биомолекулы в живых клетках с разрешением 30 нанометров. Преимуществом этого метода является его простота и универсальность различных доступных КОНъюгатов BODIPY, которые обеспечивают долгосрочный источник сигналов одной молекулы.
Наше продемонстрировано применение может стать важным, чтобы получить информацию в таких заболеваниях, как жировые заболевания печени или диабет типа 2 путем решения липидных капель и жирных кислот ниже предела дифракции. Мы получаем представление о жирной кислоты и липидных капель биологии в дрожжей и клеток млекопитающих. Тем не менее, этот метод применим ко всем другим прозрачным типам клеток с низкой фоновой флуоресценцией.
При использовании техники в первый раз, убедитесь, что оптимизировать ди концентрации и лазерные силы, чтобы наблюдать яркие сигналы одной молекулы. Визуальная демонстрация этой техники важно посмотреть, как ди концентрации и оптимизации лазерной мощности приводит к ярким сигналам одной молекулы. Поддерживайте клетки млекопитающих U2OS в нефлуоресцентных DMBM с 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота четыре миллимолярновый глутамин, один миллимолянный пируват натрия, и один процент пенициллина стрептомицин антибиотики в колбе Т-25.
Разделите клетки на 70 до 80% слияние от одного до пяти, и пипетку в одном колодец из восьми пластины хорошо. Измените клетки в восьми хорошо пластины в течение 12 до 24 часов. За десять минут до визуализации, добавить BODIPY-C12 Lysotracker зеленый или и другие СПряжения BODIPY, добавить окончательную концентрацию 100 наномолярных.
Намонтировать соответствующие наборы фильтров в пути выбросов на основе используемого цвета выбросов BODIPY. Включите микроскоп. Микроскопная сцена, 488 нанометров и 561-нанометровые лазеры, а также камера.
Добавьте каплю появляются масла на микроскоп цели. Откройте программное обеспечение HAL4000, которое управляет светодиодным светом для яркой визуализации поля, лазерной силы, лазерных ставней и настроек камеры для визуализации. Установите увеличение EMCCD до 30 и температуру камеры до минус 68 градусов по Цельсию.
Подготовь камеру и соответствующее программное обеспечение для записи фильмов на 20 Герц. Включите нагреватель сцены микроскопа и установите его до температуры 37 градусов по Цельсию и до уровня углекислого газа в пять процентов. Соответствующим образом отрегулируйте цвет объективной коррекции.
Намонтировать образец на стадии микроскопа и сосредоточиться до фокусировки системы занимается. Переместите сцену с помощью контроллера сцены до тех пор, пока здоровые ячейки не появятся в поле зрения. Загрузите лазерные последовательности затвора для возбуждения монума, а также диммеров, которым лазерная мощность 561-нанометрового лазера составляет от 821 киловатт на квадратный сантиметр для микроскопии локализации одной молекулы, так что в красном канале выбросов обнаруживаются одноярусные поры флуоресценции.
Отрегулируйте мощность лазера между точкой 035 и точкой 07 Вт на квадратный сантиметр для 488-нанометрового лазера, так что обычная флуоресценция появляется в зеленом канале излучения. Выберите папку назначения для фильмов и завехать 5000-20000 кадров для сбора достаточного количества локализаций для восстановления изображений с супер разрешением. Перемещение в различные поля зрения и повторить для сбора данных для большего количество ячеек.
Загрузите фильм в программное обеспечение для анализа локализации одной молекулы. Визуально экран фильма и настроить настройки контраста, так что одна молекула флуоресцентные мигает видно. Установить параметры идентификации одной молекулы для установки 2D Gaussian, PSFs.
Визуально экран через некоторые примеры кадров, чтобы проверить параметры идентификации, и надежно обнаружить различные одной молекулы флуоресцентные всплески. Пресс-анализ для выполнения одной молекулы локализации микроскопии представьте себе анализ с оптимизированными параметрами идентификации. А затем, сделать каждую молекулу, как 2D Gaussian, ширина которого взвешивается обратный квадратный корень обнаруженного количества фотонов.
Оцените качество данных. Используйте ограниченные диапазоны кадров для наблюдения за распределением одной молекулы в более конкретных экземплярах и времени. Это объясняет движение органелл во время сбора данных.
В этом исследовании мы представили оптимизированную процедуру подготовки выборки, сбора данных и анализа с помощью микроскопии локализации одной молекулы с использованием конъюгатов BODIPY. Чтобы продемонстрировать пример рабочего процесса для приобретения и анализа данных микроскопии одной молекулы, BODIPY в дрожжах был использован для решения липидных капель ниже предела оптической дифракции. Здесь показаны примеры различных многоцветных режимов визуализации BODIPY в спряжении с другими зондами, такими как GFP и mEos2.
BODIPY-C12 образуется в передвижных нелипидных скоплениях капель на периферии клеток при посте, в отличие от их включения в липидные капли в условиях питания. Для дальнейшего расширения одной молекулы локализации микроскопии возможности BODIPY конъюгации млекопитающих клеток, BODIPY-C12 и Lysotracker зеленый в живых клетках U2OS были изображены. Оптимизация концентрации BODIPY, а также захватывающие лазерные силы являются критическими шагами для того, чтобы визуализировать яркие сигналы одной молекулы, и реконструировать изображения супер разрешения.
Этот метод может быть использован с любым другим СПряжением BODIPY, чтобы получить высокое разрешение понимания, в специальном временном распределении конкретных био-молекул внутри живых клеток. Наша техника проложила путь, чтобы еще больше допросить липидные капли и жирные кислоты биологии наноскопической шкале линзы. Тем не менее, это приложение выходит далеко за рамки конкретных филопектетов из-за наличия различных функциональных СПряжений BODIPY.
Пожалуйста, не забудьте следовать стандартным операционным процедурам для обработки биологических образцов и красителей, а также быть нашими обязанными хеджеров и следовать процедурам лазерной безопасности.
