Наш протокол позволяет проверить скольжение металла для ортопедических имплантатов против суставного хряща и тем самым исследовать влияние фокусных имплантатов или гемиартропластики на биосинтетической активности конкретных хондракитов основным преимуществом этой техники является то, что она обеспечивает всестороннее понимание как трибологических свойств, так и биологических эффектов механической нагрузки в спаривании хряща. Этот метод может дополнять клинические результаты после хирургических процедур, таких как имплантация фокусных металлических имплантатов для лечения остеохондроза коленного сустава или гемиартропластики тазобедренного сустава. Демонстрация процедуры будет Кристофер Бауэр postdoc из моей лаборатории здесь, в Дунайском университете.
Используйте коммерчески доступный взаимный трибометр с цилиндром на конфигурации пластины, вертикальные возможности загрузки и регулируемую нагрузку и скорость скольжения. Кроме того, для проведения испытаний в смазочковом растворе требуется жидкая клетка. Зафиксируете остеохондровые цилиндры на нижнем держателе образца с маркировкой, выровненной с скользящим направлением.
Начните с определения контактного давления в молибдене хрома кобальта на хрящевой системе с помощью пленки измерения давления. Поместите пленку измерения давления на интерфейс, и применить статическую нагрузку в течение 30 секунд, чтобы определить первоначальное давление контакта, размер контакта и форму. Намонтировать цилиндры кобальтового хрома молибдена на верхнюю ячейку нагрузки.
Добавьте испытательный раствор в жидкую клетку, чтобы погрузить остеохондровый цилиндр и покрыть раздвижной интерфейс металлического хряща. Установите параметры тестирования, такие как описанные в нормальном силовом ударе и скорости скольжения, которые будут поддерживаться на протяжении всего теста. Начните взаимное скольжение металлического цилиндра против суставного хряща, погруженного в смазочковый раствор.
Мониторинг коэффициента трения на протяжении всего эксперимента, прекратить эксперимент. После периода тестирования желания удалить остеохондрольную вилку из образца владельца промыть его с PBS и хранить его в среде до дальнейшего биологического анализа. Держите контрольные образцы и решение для тестирования при комнатной температуре в течение всего теста и анализируйте их вместе с образцами, подвергшимися механической нагрузке.
Место, 24 хорошо пластины по шкале и обнулить его. Промыть остеохондрозную вилку с помощью PBS и поместить его в чашку Петри. Затем используйте скальпель, чтобы вырезать хрящ из трансплантата в один кусок разрезать хрящ на две равные части, так что контактная область равномерно распределена на обоих кусочков хряща и фарш на половину примерно на один миллиметр куб кусок.
Используйте вторую половину для анализа экспрессии генов передачи рубленого хряща в один колодец подготовленного на 24 хорошо пластины и определить вес ткани повторить этот процесс для каждого образца и добавить один миллилитр среднего роста к каждому хорошо пластины. Добавьте 500 микролитров раствора XTT в каждую колодец и перемешайте затем инкубировать пластину при 37 градусах цельсия и 5%углекислом газе в течение четырех часов после инкубации удалить супернатант и перенести его в пятими миллилитровую трубку. Извлеките продукт тетразолия, добавив 500 микролитров DMSO в хрящевую ткань в каждой хорошо и применять непрерывное возбуждение в течение одного часа при комнатной температуре, удалить раствор DMSO и вытащить его с ранее собранным раствором XTT.
Передача 100 микролитров каждого образца в триплицитах на пластину 96 хорошо. Используйте считыватель пластин для измерения поглощения на длине волны 492 нанометров и эталонной длины волны 690 нанометров. Для изоляции РНК фарша вторая половина хрящевой ткани, полученной из остеохондроза, небольшими кусочками перенесите ткань в трубку, содержащую керамические бусы и 300 микролитров лицензированного буфера.
С 1%бета меркаптоэтанол использовать коммерческий лисат для гомогенизации ткани применения 6, 500 об /мин в течение 20 секунд четыре раза с 20 минут охлаждения фазы после каждого запуска. Добавьте 20 микролитров протеиназы K и 580 микролитров РНК бесплатной воды в каждый образец, и инкубировать их при 55 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Центрифуга образцов в течение трех минут при 10 000 раз G и передачи супернатанта в 1,5 миллилитров труб.
Добавьте 0,5 тома 90% этанола в каждую трубку и перемешайте затем перенесите 700 микролитров образца в колонку связывания РНК в двухмилилитровой трубке сбора и центрифуге в 8000 раз G в течение 15 секунд. Отбросьте поток через и повторите шаг центрифугации для остальной части лисата. Добавьте в столбец 350 микролитров буфера RW one.
Центрифуга его на 8000 раз G в течение 15 секунд и отказаться от потока через. Смешайте 10 микролитров раствора ДНК и 70 микролитров буферного RDD. Добавьте раствор в мембрану очистки РНК и инкубировать его при комнатной температуре в течение 15 минут, затем добавьте 350 микролитров буфера RW один к колонке.
Центрифуга его на 8000 раз G в течение 15 секунд и отказаться от потока через добавить 500 микролитров буфера RPE в столбец очистки РНК и центрифуги его на 8, 000 раз G в течение 15 секунд отбросить поток через и добавить еще 500 микролитров буфера RPE в колонку очистки РНК затем центрифуга его в 8000 раз G в течение двух минут место колонки в новой трубке сбора 1,5 миллилитров и добавить 30 микролитров РНК бесплатная водяная центрифуга трубки в 8000 раз G в течение одной минуты, чтобы ссылаться на РНК синтезированных cDNA с помощью коммерческого комплекта оттепели и смешать все регионы, добавить образец РНК и выполнить реакцию и тепловой циклер, как описано в тексте рукописи. Добавьте девять микролитров мастер-микса РТЗ ПЦР, и один микролитр cDNA к каждой пластине из 96 хорошо пластины с каждым образцом в тройном светится ПЦР пластины с потолочным маслом и центрифуг его в 877 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия выполнять РТС ПЦР и точность и тепловой циклер. В соответствии с рукописными указаниями.
Перед тестированием контактной области и контактного давления на металлическом хрящевом интерфейсе должны быть подтверждены с помощью пленки измерения давления. Физиологическое состояние нагрузки может быть подтверждено путем сравнения полученного отпечатка со эталонным выводом для определенного контакта Низкий коэффициент трения может поддерживаться в течение по крайней мере одного часа с мигрирующей областью контакта. Внеклеточный матричный состав и структура могут быть определены с шафраном и O окрашивания.
Интенсивность шафрана и Окрашивания пропорциональна содержанию протеогликана. Содержание протеогликана варьируется по поверхности суставов, но должно быть однородным по всему разделу ткани в базовых образцах, показывают извлечения гликозаминогликанов, которые могут быть противодействовать механической нагрузки. Метаболическая активность бычьего суставного хондрацита не зависит от места сбора урожая, но показывает увеличение с механической нагрузкой.
Уровни экспрессии генов хряща увеличились при физиологических условиях нагрузки. В то время как катаболические гены регулируются стационарной зоной контакта. После этой процедуры может быть проведен дополнительный анализ, включая определение продуктов хрящевой паутины и анализ суставной поверхности с помощью сканирующей электронной микроскопии и, кроме того, мы стараемся оптимизировать смазку суставного хряща в различных трибологических пар.
