Клеточные линии HCC4017 и HBEC30KT были любезно предоставлены лаборатории доктора Джона Минны. Эта работа была поддержана за счет средств Сесил Х. и Ида Зеленые доктору Ли Чжан.

ВНИМАНИЕ: При работе с радиоактивностью, принять соответствующие меры предосторожности, чтобы избежать загрязнения экспериментатора и окрестностях. Утилизировать все отходы от следующей местными правилами радиационной безопасности. 1. Подготовка клеток <ol><li> Семенной клеток в 3,5 см пластинах таким образом, что конфлюентности достигает 80% -90% в день анализа. <ol><li> Следует отметить, что посев слияния для клеток зависит от типа клеток и скорости их роста. При лечении клеток с реагентом в течение определенного количества дней, семена клетки таким образом, что конфлюентности в 80% -90% в день измерения гема. Если количество клеток, полученных из пластин 3,5 см недостаточна, используют 6 см пластины с таким же количеством радиоактивного ALA, как в следующем шаге. Примечание: Использование отдельных пластин рекомендуется, потому что это проще в обращении отдельных пластин. </li></ol></li><li> Накануне измерения гема, добавить 0,1-0,3 мкКи [14 C] 5-ALA и холодной ALA, чтобы достичь окончательного грoncentration 20 мкМ общего ALA к каждой культуре блюдо в рабочей области, пригодный для работы с радиоактивными материалами и поставить пластины обратно в инкубатор. В идеале, инкубировать с радиоактивным ALA в течение 16 часов. Примечание: с радиоактивной 5-АЛК необходимости может варьироваться от клеточных линий. Радиоактивный значение в минуту (CPM) по меньшей мере 100 требуется, чтобы свести к минимуму ошибку, связанную с подсчетом. Желательно, чтобы определить минимальное количество [14 C] 5-АЛК, необходимое для клеточных линий при исследовании. Для большинства экспериментов 0,1-0,3 мкКи достаточно, чтобы получить хорошее измерение. Добавление холодного ALA является обязательным. </li></ol> 2. Гем Добыча <ol><li> Поместите культуры клеток блюда на льду и принять их в район, пригодный для работы радиоактивности. <ol><li> Выполните всю добычу и процесс испарения в взрывозащищенном капотом. Потому что хранится эфир может взорваться, использовать эфир в бутылочках и испарится оставшиеся жидкостей, не храните эфир воткрытая бутылка для более чем одного месяца. Не используйте ацетон вблизи открытого огня и нагревательных как это является легковоспламеняющимся. Магазин ацетон, содержащий реагенты в стеклянных бутылках, как она растворяется культуры ткани пластмасс. </li></ol></li><li> Аспирируйте от среды с использованием пипетки. Вымойте клеток один раз 1 мл PBS 1x холодной. Аспирируйте от PBS. </li><li> Добавить 1 мл холодного PBS 1x на пластины и сбора клеток в нижней части пластины с помощью резинового шпателя. Передача собранных клеток из каждой пластины с меченым предварительно охлажденные 2 мл пробирку. Собирают все клетки в 2 мл пробирки. Примечание: Используйте свежий резиновый полицейский для каждой пластины для соскабливания клеток из каждой пластины. Для каждой пластины вам потребуется четыре 2 мл пробирки, 1,5 мл трубки и сцинтилляционный флакон. </li><li> Спин при 15000 х г в течение 1 мин при 4 ° С. </li><li> Выньте PBS с помощью пипетки, дать краткий спина и удаления остатков PBS. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 1х PBS. Вихрь ресуспендировать клетки и держать на льду. </li><li> Возьмите 10 &amp;# 956; л из стадии 5 и переносят в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и хранить на льду для измерения концентрации белка. Примечание: Сотовый буфера для лизиса должны быть добавлены к клеткам и выдерживали на льду для измерения концентрации белка позже. </li><li> Спин оставшиеся 90 мкл шаг 5 при 5000 х г в течение 30 сек при 4 ° С; удалить PBS полностью используя пипетки 200 мкл. </li><li> Добавить 300 мкл буфера для экстракции гема (см список материалов) в каждую пробирку. Затем вихрь в течение 15 сек, чтобы смешать и поставить на льду в течение 1 мин, повторить это 3 раза. <ol><li> Добавить буфер для экстракции гема (Евр) и вихрь трубку быстро ресуспендируют осадок, сделать только один или два тюбика на время, потому что осадок должен быть быстро ресуспендировали без слева в СЭП слишком долго. После Древнеевр добавляется всех труб и осадок ресуспендировали затем следуйте 15 сек вихрь и 1 мин на цикл льда, как на стадии 8. Обратите внимание, что осадок не может полностью перейти в СЭП, если осадок остается в буфере ВЭП для дольшевремя и не ресуспендировали быстро. </li></ol></li><li> Добавить 1,2 мл диэтилового эфира в каждую пробирку и вихря в течение 30 сек. Спин при 15000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Примечание: диэтиловый эфир заканчивается наконечники пипеток быстро. Для управления этим, пипетки диэтиловый эфир вверх и вниз один или два раза, это помогает держать диэтиловый эфир в пипетку. Повторите это каждый раз свежий пипетки используется. </li><li> Перевести верхний (эфир) фазы с 1 мл пипетки на новый микроцентрифужных трубки. Добавить 0,5 мл 2 N HCl, вихря, чтобы смешивать и спина, как в шаге 9. Примечание: Это трудно увидеть разделение между эфиром и HCl фаз. Поэтому, добавьте небольшое количество трипанового синего в 2 раствора HCl, чтобы использовать во время эксперимента, достаточно, чтобы дать ему бледно-голубой цвет. Это поможет различать две фазы. Нижняя фаза будет синим, а фаза верхнего эфир будет бесцветным. Передача верхний бесцветный эфирную фазу в новую пробирку и отбросить нижнюю HCl (синий) фазу. </li><li> Повторите шаг 10 дванесколько раз, чтобы промыть эфирную фазу с помощью 2N HCl. Передача только верхний эфирную фазу в новую пробирку при каждом повторении и выбросить нижнюю фазу HCl. </li><li> После третьей промывки HCl, передавать верхнюю фазу с 1 мл пипетки в сцинтилляционный флакон. Высушите образцы путем испарения диэтилового эфира, сохраняя образцов в химической капот O / N. </li></ol> 3. Измерение радиоактивности <ol><li> На следующий день, добавить 5 мл сцинтилляционной жидкости для высушенных образцов, начиная с шага 2.12. </li><li> Хорошо встряхните, чтобы перемешать. Измерение радиоактивности с помощью сцинтилляционного счетчика. </li></ol> 4. Расчеты <ol><li> Лизировать клетки, полученные на стадии 2.6, используя равные количества CelLytic М буфера (см Материалы список) и спина при 14000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. </li><li> Возьмем аликвоту супернатанта и измерить концентрацию белка использованием BCA комплект для анализа белка. Общее количество белка в мг (TP) = (90 мкл * конц. Белка в81 г / мкл) / 1000 Уровень синтеза Гем (радиоактивность / TP) = пмоль / мг белка. </li></ol>

Мы не имеем ничего раскрывать.

Гем играет ключевую роль в генерации клеточной энергии через дыхание 26. Altered метаболизма гема, как известно, связаны с различными заболеваниями, включая рак 28,41. Ингибирование синтеза гема, как известно, вызывают остановку клеточного цикла и апоптоз клеток HeLa в 26,41. Был?...

Гем, комплекс двухвалентного железа и протопорфирина IX является центральным молекула для транспортировки и использования кислорода практически во всех живых организмах 1-3. Уникальная структура гема позволяет ему функционировать в качестве носителя двухатомных газов и электронов, а также для выполнения других функций 1-5. Например, гем связывается с кислородом гемоглобина и миоглобина для передачи и хранения кислорода 6,7. Она также работает в качестве носителя электронов в цитохромов при дыхании и действует в качестве донора электронов для окислительно-восстановительных реакций, катализируемых ферментов цитохрома P450 8,9. Одним из наиболее важных особенностей является то, что гема, он может играть регуляторную роль в клеточных и молекулярных процессов, таких как транскрипции генов, синтез белка и РНК микро-биогенезе 4. Например, он влияет на транскрипцию многих генов, контролируя активность млекопитающих репрессор транскрипции Bach1 и млекопитающих ядерного RECeptor Rev-erbα 10-15. Гем регулирует активацию гема активатора протеина (НАР) 1, который играет важную роль в активации генов, участвующих в дыхании и контроля окислительного повреждения, в ответ на гема или кислорода 16. Гем также регулирует транскрипцию генов в нервных клетках через фактор роста нервов (ФРН) сигнализации 3,17-20. Он также регулирует синтез белка в эритроидных клетках млекопитающих путем модулирования активности гема регулируется eIF2α киназы (HRI) 21-24. Кроме того, гем влияет на активность ключевых сигнальных белков, таких как тирозин-киназы Jak2 и Src, которые имеют важное значение для нормального функционирования клеток и роста клеток 4,20,25. Было обнаружено, что в клетках HeLa клетки ингибирования гема вызывает остановку клеточного цикла и активацию маркеров, связанных со старением и апоптозом 26. И дефицит Гем или повышенные уровни гема связаны с тяжелыми последствиями для здоровья человека в 27. Последние молекулярнойй эпидемиологические исследования показали положительную ассоциацию высоким потреблением гема и повышенный риск заболеваний, таких как сахарный диабет 2-го типа, ишемической болезни сердца и некоторых форм рака, включая рак легких, колоректальный рак и рак поджелудочной железы 27,28. Используя согласованную пару лаборатории нормальными и раковыми клетками легких авторов показали, что раковые клетки имеют повышенный уровень потребления кислорода, синтеза гема и белков, участвующих в поглощения гема и кислорода утилизации 28. Интересно, что ингибирование синтеза гема уменьшилось потребление кислорода, пролиферацию, миграцию и образование колоний раковых клеток 28. Таким образом, колебание уровней эндогенного гема играет важную роль в регуляции молекулярных и клеточных процессов 3,4,28,29. У млекопитающих, биосинтез гема происходит в восьми шагов, с участием ферментов, расположенных в митохондриях и цитозоле 4 (рисунок 1). Гем Биосинетезис начинается в матрице митохондрий с конденсацией глицина и сукцинил-КоА с образованием 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК), катализируемой ALA-синтетазы (увы) 4,31. Это скорость шаг в гем биосинтеза в клетках nonerythroid ограничения. 5-АЛК затем экспортируется в цитозоль, где в ближайшие четыре шага произойти, чтобы сформировать coproporphyrinogen III (CPgenIII), который затем импортировать обратно в митохондрии, где он превращается в протопорфирина IX (PPIX). Наконец, одна молекула железа включена в протопорфирина IX (PPIX) для получения гем, реакции, катализируемой феррохелатазы (FECH) 2,4. Уровень биосинтеза гема, зависит прежде всего от уровня ALAS фермента, который жестко контролируется внутриклеточного железа гема и 4. Биосинтез гема могут быть затронуты генетических дефектов, наличие определенных витаминов и минералов (например, рибофлавин, цинк), воздействие токсинов (например, алюминия, свинца), Аноксии, лихорадка, и уровни некоторых стероидов (например, эстроген) 32-35. Уровень синтеза гема изменяется в различных болезненных состояниях. Снижение гем биосинтеза может привести к анемии, а также неврологических заболеваний 3,36. Кроме того, увеличилась гема биосинтеза играет важную роль в прогрессировании некоторых видов рака 28,37. Гем было показано, является критическим для роста, дифференцировки и выживания жировой млекопитающих, эритроидных и нервных клеток 4,38-41. Например, дефицит гема приводит к повреждению нейритов в первичной мыши корковых нейронов через ингибирование глутамата NMDA (N-метил-D-аспартат) рецепторов 17. Кроме того, ингибирование синтеза гема вызывает запрограммированную гибель клеток в человеческой эпителиальной карциномы шейки HeLa клетки 26,41. Таким образом, измерение уровней гема биосинтеза в различных клетках при различных условиях является важным для изучения этиологии и progressiна многих заболеваний. Здесь мы опишем быстрый и чувствительный метод для измерения уровня внутриклеточного синтеза гема с помощью [4- 14 C] 5-aminolevulic кислоты. Это альтернативный метод с другими методами с использованием 55 или 59 Fe Fe. Мы предпочитаем использовать 14 C, потому что его излучение очень слабое. В отличие от этого, сильная защита требуется для работы с Fe изотопов. Кроме того, этот метод предназначен для измерения и сравнения синтез гема в разных клетках параллельно в быстрой манере. Для того чтобы измерить абсолютные уровни гема, можно использовать ранее установленную способ, включающий использование ВЭЖХ 42,43.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Гем служит простетической группы для широкого спектра белков, известных как гемопротеинов, таких как гемоглобин, миоглобин и цитохромы. Он участвует в различных молекулярных и клеточных процессах, таких как генной транскрипции, трансляции, клеточной дифференцировке и пролиферации клеток. Уровни биосинтеза гема варьироваться в зависимости от различных тканей и типов клеток и изменяется в болезненных состояниях, таких как анемия, невропатии и рака. Эта методика использует [4- 14С] 5-аминолевулиновой кислоты ([14С] 5-АЛК), один из ранних предшественников в пути биосинтеза гема, чтобы измерить уровни синтеза гема в клетках млекопитающих. Этот анализ включает в себя инкубации клеток с [14 C] 5-ALA с последующим экстрагированием гема и измерения радиоактивности, включенного в гема. Эта процедура является точной и быстрой. Этот метод измеряет относительные уровни гем биосинтеза, а не общее содержание гема. Чтобы продемонстрировать использование этого технIQUE уровни биосинтеза гема были измерены в нескольких клеточных линий млекопитающих.

Этот метод был использован для сравнения уровней синтеза гема в нормальном (HBEC30KT) против раковых (HCC4017) легочных клеток. Рисунок 2 показывает более высокий уровень синтеза гема в раковых клетках (HCC4017), чем нормальные клетки легких (HBEC30KT). Уровень синтеза гема также измеряли в нор...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells at JoVE.com

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Измерение уровней Гем синтез в клетках млекопитающих

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

measurement-of-heme-synthesis-levels-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Views.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Video: Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing и субкультивирования клетках млекопитающих

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

Биолюминесценция Визуализация гемоксигеназы-1 регуляция в порядке Гуа Ша

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

В месте субклеточных Фракционирование Приверженец и не соблюдают клетках млекопитающих

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Анализ ДНК двухцепочечной Break (DSB) Ремонт в клетках млекопитающих

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

МИССИЯ esiRNA для скрининга RNAi в клетках млекопитающих

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Анализ мРНК ядерного Кинетика Экспорт в клетках млекопитающих по Микроинъекция

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

МИССИЯ LentiPlex Объединенные shRNA библиотеки Скрининг в клетках млекопитающих

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Анализ сотового Позиция цикла в клетках млекопитающих

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Визуализация эндоплазматического ретикулума Локализованные мРНК в клетках млекопитающих

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.