Этот метод рассматривает, как анализировать процессы развития, такие как мышечные сокращения и прокатки, которые происходят в эмбрионе Дрозофилы. Некоторые преимущества этого метода в том, что он неинвазивный и довольно подробный, но это относительно простой в работе. Наш метод может быть разработан для скрининга на основе анализа высокого содержания для изоляции и анализа новых мутаций, влияющих на сокращение эмбриональных мышц и другие процессы развития.
При визуализации мышечных сокращений, важно правильно время сбора эмбрионов, потому что сокращения начинаются только на определенной стадии развития. Пошаговая визуальная демонстрация может в значительной степени помочь в количественном анализе процессов развития. Для живой визуализации установленных эмбрионов дрозофилы поместите эмбрионы на стадию эпифлуоресцентного микроскопа с функцией таймлапса и цифровой камерой с подходящими фильтрами выбросов и выберите объектив для погружения в воду 10X.
Затем в прямом эфире записывают эмбрионы с помощью соответствующего программного обеспечения для записи микроскопа в течение примерно одного-двух часов со скоростью приобретения четырех кадров в секунду. В конце эксперимента экспортируйте записанное видео непосредственно в ImageJ. Выберите изображение и урожай, чтобы нарисовать коробку вокруг каждого отдельного эмбриона, чтобы обрезать видеозаписи размером с каждый эмбрион.
Нажмите изображение, преобразование и поворот, чтобы повернуть обрезанные изображения для достижения вертикального положения эмбриона средней линии по отношению к экрану. Чтобы установить измерения расстояния до микрометров, нажмите Анализ и Установить шкалу, а затем введите известный пиксель к коэффициенту микрона коэффициент преобразования для установки микроскопа. Все последующие измерения будут затем сообщены в микрометрах.
Чтобы проанализировать прокатку эмбриона, сначала отметайте положение одной или обеих трахеи эмбриона в первом кадре видео на полпути между задней и передней концами и нажмите Анализ, Инструменты и регион интереса менеджера. Нарисуйте приблизительно семь микрометров на семь микрометров вокруг трахеи и нажмите клавишу T на клавиатуре, чтобы записать эту позицию в качестве координаты XY. Отметьте положение одной и той же области трахеи после перистальтических сокращений интереса и нарисуйте линию, соединяющую центры каждой коробки, нажав M на клавиатуре, чтобы измерить расстояние от предсуженного положения до пост-сокращения позиции.
Для анализа эмбриональных мышечных сокращений с использованием эмбрионов, выражаюющих флуоресцентные мышечные маркеры, используйте запись флуоресцентного считывания, чтобы нарисовать область интереса, сосредоточенную вокруг флуоресцирующих мышц определенного сегмента тела, представляющих интерес. Выберите вкладку Add T в регионе менеджера по интересам для записи позиции региона, представляющих интерес. Нажмите Регион интерес менеджер и мера для записи средней флуоресцентной интенсивности каждого региона интересов выбран для каждого кадра видео.
Переместите коробку в центры других сегментов тела, представляющих интерес, и нажмите Add T, чтобы записать свои позиции, чтобы получить области, представляющие интерес одинакового размера во всех сегментах тела, которые будут проанализированы. В регионе менеджера по интересам удерживайте ключ управления при выборе всех областей, представляющих интерес, записанных в качестве координат XY. Нажмите Больше и Multi-Measure для измерения среднего флуоресцентного интенсивности каждого региона, представляющих интерес для всех кадров видео.
Это будет сообщать о каждом измерении в таблице с каждой областью, представляющих интерес, как столбец таблицы и каждый кадр в качестве строки. Затем перенесите таблицу в программу электронной таблицы для дальнейшего анализа. Участок график с числом кадров на х-оси и средняя интенсивность флуоресценции на оси и конвертировать число кадров в время, используя четыре кадра в секунду частоты кадров.
Мышечные сокращения увеличить интенсивность GFP, поскольку они приносят больше GFP в непосредственной близости от координационного района, как больше мышц получить вытащил во время этих сокращений. Чтобы определить амплитуду сокращения мышц, оцените базовую интенсивность GFP как среднюю интенсивность регионов между пиками. Затем оцените увеличение интенсивности флуоресценции GFP по отношению к этому базовому уровню.
Затем разделите каждый регион значения интенсивности интереса на базовую интенсивность для нормализации интенсивности GFP до базового уровня. Сравните нормализованные интенсивности GFP в задних, медиальных и передних сегментах во время волны сокращения мышц, чтобы изучить изменения в степени сокращения мышц по мере распространения волны и определить направление волны. Чтобы сравнить мышечные сокращения на левой и правой сторонах эмбриона, проанализируйте пик интенсивности для тех же сегментов по обе стороны эмбриона.
Используйте амплитуду сокращения и сроки пиков, чтобы выявить различия, если таковые имеются, и степень и время перистальтических волн сокращения мышц. Здесь показаны нормальные перистальтические сокращения мышц в эмбрионе дикого типа Дрозофилы. В этом видео прокатки в эмбрионе дикого типа, обратите внимание, что спинной придаток не двигается в то время как трахея делает указание на то, что эмбрион проката в своей оболочке.
В этом репрезентативном анализе пики сокращения мышц в период от 165 до 178 секунд представляют собой одну форвардную волну. Для этого эмбриона, никакой разницы в амплитуде и время мышечных сокращений была измерена на правой и левой сторонах эмбриона. Перистральное сокращение обозначено как передняя волна типа 1, если ее профиль имеет пик, который возникает в задней области, за которой сначала следуют пики в средних и передних регионах.
Обратная волна типа 1 является пиком, который сначала возникает на передних сегментах, а затем распространяется в сторону задних областей. Волны типа два начинаются на одном конце эмбриона и ими идут к средним регионам, прежде чем вернуться к своему происхождению, так как радикальная волна вновь инициируется на противоположном конце. Тело осанки мутант эмбрионов продемонстрировать ненормальные относительную частоту типа один на тип двух волн поколения, что приводит к аномалии осанки тела назначен в качестве тела ксерсиона или вращения фенотипа.
Для использования флуоресценции в качестве считывания параметров сокращения мышц, важно использовать эмбрионы с репортером в мышечной ткани. Этот метод может быть использован для одновременной записи мышечных сокращений многих эмбрионов и для оценки реакции на различные раздражители, препараты или изменения окружающей среды.
