Наш протокол поможет исследователям понять физиологические эффекты трех различных методов трансплантации костного мозга и то, как они влияют на экспериментальные результаты в условиях клонального кроветворения. Трансплантация костного мозга в целом может негативно повлиять на сердечно-сосудистые органы и изменить патогенез заболевания. Таким образом, наша лаборатория разработала два альтернативных метода, чтобы минимизировать или избежать возможных побочных эффектов.
Демонстрировать процедуры будет Ынби Парк, аспирант, и Меган Эванс, постдокторант, оба из моей лаборатории Для защиты грудной клетки и брюшной полости поместите регулируемый лоток и рентгеновский облучатель на правильное расстояние для достижения равномерного облучения. И поместите обезболенные мыши на плоскую светодиодную пластину, перевернутую друг к другу в лежачем положении. Закрепите лапы на пластине скотчем и поместите светодиодное экранирование так, чтобы нижний конец выровнявался с костью xiphisternum, а верхний конец свинцового щита сидел рядом с тимусом.
После экранирования поместите мышей в облучатель и подвергайте животных двум 5,5 серым фракциям облучения, разделенным интервалом от четырех до 24 часов. Для защиты головы осторожно приклейте четыре лапы мыши к брюшку. Поместите мышь в конический ограничитель и сдвиньте ограничителя в прорезь внутри свинцового щита, чтобы голова и уши мыши были полностью закрыты, оставив остальную часть тела мыши подверженной воздействию радиации.
После экранирования поместите мышей в облучатель и подвергайте животных воздействию 5,5 серых фракций излучения, разделенных интервалом от четырех до 24 часов. После каждой лучевой терапии помещайте обезболиваемых мышей в клетку на нагретый коврик с контролем до полного выздоровления. Чтобы изолировать кости, продезинфицируйте кожу мыши-донора 70% этанолом и сделайте небольшой поперечный разрез кожи ниже грудной клетки.
Крепко держа кожу по обе стороны разреза, разрывайте в противоположных направлениях к голове и ногам и отшелушивайте кожу со всех конечностей. Разрезайте плечи и локтевые суставы и используйте лабораторную салфетку, чтобы удалить прикрепленные мышцы и соединительные ткани из плечевой кости. Осторожно вывихивают суставы между бедренной и бедренной костями.
И используйте тупые ножницы, чтобы разрезать вдоль головок бедренной кости, чтобы отсоедать ноги. Разрезать коленный сустав, отделить бедренную и большеберцовую кости. И используйте лабораторные салфетки, чтобы аккуратно удалить прикрепленные мышцы и соединительные ткани из костей.
Затем вытяните кости мышей того же генотипа в отдельные 50-миллилитровые конические трубки, содержащие 20 миллилитров ледяного стерильного PBS на льду. Чтобы изолировать клетки костного мозга в шкафу класса биобезопасности два, используйте иглу 18 калибра, чтобы сделать небольшое отверстие в нижней части стерильной микротрубки 500 микролитров. И поместите трубку в индивидуальную стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую 100 микролитров ледяного холодного стерильного PBS.
Когда все трубки будут подготовлены, извлеките PBS из трубки, содержащей изолированные кости, и перенесите кости на стерильную 100-миллиметровую чашку для культивируемых клеток. Используйте тонкие щипцы и небольшие ножницы, чтобы аккуратно удалить эпифиз с концов каждой кости, и поместите до шести костей в каждую трубку размером 500 микролитров. Когда все кости будут разрезаны, извлеките клетки костного мозга путем центрифугирования.
Если все содержимое костного мозга было удалено, кости должны казаться белыми и полупрозрачными с относительно большой красной гранулой на дне 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубки. Для трансплантации клеток костного мозга разбавьте изолированные клетки костного мозга в свободной от сыворотки среде RPMI и загрузите 200 микролитров клеточной суспензии в один шприц инсулина 0,5 миллилитра на одну инъекцию мыши. После подтверждения отсутствия реакции на педальный рефлекс медленно вводят весь объем клеток в ретроорбитальную вену каждого анестезированного животного-реципиента.
Затем поместите каплю пропаракаина на глаз для облегчения боли. И позвольте мыши прийти в сознание во время наблюдения. Сравнить влияние трех методов предварительного кондиционирования ТКМ на приживление донорских клеток.
Фракции донорских клеток в периферической крови и сердечной ткани анализировали с помощью проточной цитометрии через месяц после ТКМ. В этом репрезентативном анализе в периферической крови мышей-реципиентов, получающих общее облучение тела, моноциты, нейтрофилы и В-клетки были в значительной степени абляции и заменены потомство донорских клеток, полученных из костного мозга. Кроме того, популяции сердечных моноцитов и нейтрофилов были почти полностью заменены клетками донорского происхождения.
В группе частично экранированного облучения замена сердечных иммунных клеток донорского происхождения была скромной. Клетки костного мозга мыши-реципиента в экранированных областях, вероятно, способствовали более низкому уровню восстановления периферической крови по сравнению с мышами, которые получали общее облучение тела. В группе без предварительного кондиционирования ТКМ донорские клетки были обнаружены в периферической крови и сердцах мышей-реципиентов через четыре недели после ТКМ.
Кроме того, дефицитные донорские клетки Tet2 постепенно расширялись с течением времени. Для сравнения, мыши-реципиенты, привитые донорскими клетками дикого типа, показали минимальное клональное расширение донорских клеток. Их оптимизация этих экспериментальных моделей позволит более тщательно истолковать гены-драйверы клонального кроветворения, которые способствуют смертности от всех причин, таких как кардио-метаболические заболевания и рак.
Мы надеемся, что наши протоколы позволят исследователям изучать клональный кроветворение, чтобы исследовать, как он способствует сердечно-сосудистым заболеваниям и другим болезненным состояниям.
