Этот метод демонстрирует трансфекцию первичных пигментных эпителиальных клеток человека на основе электропорации с использованием транспозонной системы «Спящая красавица», что свидетельствует о экспрессии трансгенов и секреции белка. Комбинация транспозонной системы Sleeping Beauty и электропорации обеспечивает эффективную трансфекцию первичных пигментных эпителиальных клеток человека, а также стабильную и стойкую экспрессию трансгенов и секрецию белка. Общая цель состоит в том, чтобы создать клеточную генную аддитивную терапию для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки, которая требует стабильной и стойкой секреции терапевтически активного белка.
Продемонстрировать процедуру будут Энн Фрайалденховен и Антье Шифер, медицинские технические ассистенты из лаборатории. Чтобы подготовить плазмидную ДНК к первичной электропорации клеток RPE человека, используйте микрообъемный спектрофотометр для количественной оценки содержимого плазмидной ДНК и отрегулируйте концентрацию до 250 нанограммов на микролитр в 10 миллимолярах Tris-HCL. Смешайте один объем 250 нанограмм на микролитр транспозазной плазмидной ДНК SB100X с 16 объемами 250 нанограмм на микролитр пигментного эпителия, полученного из фактора транспозона плазмидной ДНК.
Добавьте два микролитра полученной плазменной смеси в стерильную 1,5-миллилитровую безопасную микроцентрифужную трубку на льду и заполните буферную трубку тремя миллилитрами буфера E. Затем вставьте трубку в пипетку до тех пор, пока не будет слышен щелчок, и установите устройство трансфекции на 1 100 вольт, ширину импульса 20 миллисекунд и два импульса. Подготовить ячейки к электропорации. Во-первых, проверьте морфологию первичных клеточных культур RPE с помощью фазово-контрастной микроскопии для оценки их роста и слияния.
Обрабатывайте клетки 500 микролитрами 0,05% трипсина ЭДТА на лунку в течение семи-15 минут в инкубаторе клеточной культуры. Когда клетки отделились, соберут клетки путем центрифугирования, повторно суспендируют клетки в одном миллилитре PBS и центрифугируют от одного до 10 раз 10 до четырех аликвот клеток за реакцию трансфекции. Повторно суспендируют гранулы в 11 микролитрах буфера R на пробирку и добавляют два микролитра приготовленной плазмидной смеси в каждую трубку.
Вставьте головку трансфекционной пипетки в 10-микролитровый трансфекционный наконечник до тех пор, пока зажим полностью не поднимет крепежный шток поршня, и загрузите ячейку и плазмидный раствор в наконечник трансфекции. Вставьте трансфекционную пипетку в буферную трубку, расположенную внутри пипеточной станции, пока не будет слышен щелчок, и нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать процесс электропорации. После трансфекции осторожно извлекают трансфекционную пипетку из пипетки и сразу же пипетку клеточного и плазмидного раствора в подготовленные лунки клеточной культуральной пластины.
Для очистки помеченного им пигментного эпителия получают белки факторного слияния из супернатантов клеточной культуры RPE. Во-первых, используйте конический режущий наконечник для сбора одной 30-микролитровой аликвоты никелевой NTA-суспензии на образец и гранулируйте никелевую смолу NTA путем центрифугирования. Тщательно повторно суспендируйте никелевую смолу NTA 200 микролитрами инкубационного буфера One X и гранулируйте раствор с дополнительной центрифугированием два раза.
После второй центрифугирования тщательно повторно суспендируйте гранулы никелевой смолы NTA с 40 микролитрами инкубационного буфера Four X на образец. Далее смешайте 55 микролитров одной аликвоты предварительно обработанной никелевой суспензии NTA с 260 микролитрами инкубационного буфера Four X и 900 микролитрами каждого трансефктированного супернатанта клеточной культуры RPE. Инкубируйте смесь на качающемся шейкере при комнатной температуре в течение 60 минут и снова гранулируйте смеси никелевой смолы NTA.
Тщательно повторно суспендируйте гранулы в 175 микролитрах инкубационного буфера One X и центрифугируйте смеси еще два раза. После второй центрифугирования тщательно повторно суспендируют гранулы никелевой смолы NTA в 30 микролитрах буфера Элюирования для 20-минутной инкубации при комнатной температуре с встряхиванием и центрифугированием образцов снова. Затем тщательно соберите супернатанты и смешайте их с буфером образцов Two X SDS для западного анализа очищенных белков в крови.
Культивируемые первичные клетки RPE, выделенные из глаз донора человека, демонстрируют типичную морфологию булыжника независимо от возраста донора, посмертного времени изоляции или времени культивирования. Применение кратковременных электрических импульсов к первичным клеткам RPE человека. Использование системы капиллярной трансфекции не оказывает негативного влияния на морфологию эпителия.
Западный анализ крови трансфектированных супернатантов первичной культуры клеток RPE человека демонстрирует секрецию фактора, полученного из пигментного эпителия, на постоянных уровнях без глушения трансгенов в течение более 500 дней. Как наблюдается в этом репрезентативном анализе крови клеточной культуральной среды от серийно выполняемых трансфекций, повсеместно более высокая скорость секреции фактора пигментного эпителия наблюдается через 21 день после трансфекции. В исследуемой культуре долгосрочная повышенная секреция PEDF длится не менее 165 дней.
Кроме того, количественная оценка на основе ИФА показывает 20-кратное увеличение общей секреции фактора, полученного из пигментного эпителия, в трансфектированных первичных клетках RPE человека по сравнению с соответствующими нетрансфектированными контрольными клетками. Это увеличение было также подтверждено на уровне экспрессии генов, на котором общая экспрессия PEDF была повышена более чем в 30 раз. При попытке этого протокола важно использовать пигментные эпителиальные клетки, морфология которых соответствует статусу In Vivo.
Кроме того, не забудьте втянуть клеточный раствор в наконечник трансфекции без пузырьков воздуха. Стабильно трансфектированные клетки могут быть использованы в различных моделях Ex Vivo или In vivo для проверки функциональности этой клеточной генной аддитивной терапии.
