Протокол имеет большое значение, поскольку он показывает выделение и трансфекцию пигментных эпителиальных клеток пяти млекопитающих в качестве оптимальной системы для изучения глазной генной терапии в различных установках. Основным преимуществом этого метода является его гибкость, переносимость, высокий выход клеток, жизнеспособность и скорость трансфекции благодаря пяти видам и используемой невирусной транспозонной системе SB100X. Эти методы были разработаны для изучения подходов генной терапии, нацеленных на пигментные эпителиальные клетки сетчатки и радужной оболочки глаза, которые выделены и трансфекционированы в настоящем протоколе, но могут использоваться для любых глазных исследований.
Демонстрацию процедуры будет демонстрировать Грегг Сили, техник из лаборатории. После усыпления животного используйте изогнутые ножницы и щипцы Колибри для энуклеации глаз, затем очистите оставшуюся мышечную ткань и кожу от глаз. Соберите глаза в 50-миллилитровую трубку, заполненную нестерильным PBS, и перенесите трубку в ламинарную вытяжку.
Дезинфицируйте их, погружая в раствор на основе йода на две минуты, затем перенесите глаза в 50-миллилитровую трубку, заполненную стерильным PBS. Положите один глаз на стерильный марлевой компресс и крепко держите глаз близко к зрительной нерве. Затем обрежьте около предела радужной оболочки скальпелем no 11.
С помощью ножниц обрежьте вокруг радужной оболочки и удалите передний сегмент и поместите его в чашку Петри, оставив луковицу со стекловидным стекловидом до тех пор, пока не будет выделен пигментный эпителий сетчатки или клетки RPE. Чтобы изолировать эпителиальные пигментные клетки радужной оболочки, или клетки IPE, удалите хрусталик тонкими щипцами и деликатно вытащите радужную оболочку, содержащую клетки IPE. Поместите ирис в чашку Петри и вымойте ее стерильным PBS.
Добавьте 500 микролитров 0,25% трипсина и инкубировать в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия. Удалите трипсин, добавьте 500 микролитров полной среды и деликатно соскоблите IPE плоской, отполированной огнем пипеткой Пастера. Соберите клеточную суспензию и поместите ее в 1,5-миллилитровую трубку.
Подсчитайте клетки, используя камеру Нойбауэра, и посейте 0,2 миллиона клеток на лунку в 24-луночную пластину с одним миллилитром полной среды. Поместите пластину в инкубатор и культивируете ее при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Чтобы изолировать клетки RPE, удалите стекловидное тело и сетчатку из заднего сегмента тонкими щипцами.
Поместите луковицы в 24-луночную пластину и добавьте 500 микролитров 0,25% трипсина на глаз и высиживайте в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия. Удалите трипсин, добавьте 500 микролитров полной среды на глобус и деликатно соскоблите ячейки RPE изогнутой, отполированной огнем пипеткой Пастера. Соберите клеточную суспензию и поместите ее в 1,5-миллилитровую трубку.
Подсчитайте клетки с помощью камеры Нойбауэра и засыпляйте клетки, как описано выше. Поместите тарелку в инкубатор. Очистите оставшуюся мышечную ткань и кожу от глаз и продезинфицируйте глаза в растворе на основе йода и промойте их PBS.
Чтобы изолировать клетки IPE, удалите хрусталик и вытащите радужную оболочку, как описано ранее. После приготовления двух ирисов добавьте один миллилитр полной среды и изолируйте клетки, поцарапав плоской, отполированной огнем пипеткой Пастера, затем подсчитайте и засейте клетки. Поместите тарелку в инкубатор.
Чтобы изолировать клетки RPE, удалите стекловидное стекло и сетчатку из заднего сегмента и поместите луковицу в чашку Петри. Наполните луковицу одним миллилитром полной среды. С помощью изогнутой, отполированной огнем пипетки Пастера удалите ячейки RPE.
Соберите клеточную суспензию внутри колбы, используя пипетку 1000 микролитров, и перенесите ее в трубку размером 1,5 миллилитра для повторного суспендирования. Затем подсчитайте и посейте клетки и инкубируем пластину, как было продемонстрировано ранее. После очистки откройте глаз и обрежьте вокруг радужной оболочки, чтобы удалить передний сегмент, затем положите в чашку Петри.
Оставьте луковицу со стекловидным стекловидом до тех пор, пока клетки RPE не будут изолированы. Чтобы изолировать клетки IPE, если хрусталик приходит с передним сегментом, удалите хрусталик и используйте тонкие щипцы, чтобы деликатно вытащить радужную оболочку, содержащую клетки IPE. Поместите ирис в чашку Петри и вымойте ее стерильным PBS.
Режут цилиарное тело скальпелем No 10. После приготовления ирисов высиживают их двумя миллилитрами 0,25% трипсина при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Удалите трипсин и добавьте два миллилитра полной среды, затем изолируйте клетки, поцарапав плоской, отполированной огнем пипеткой Пастера.
Переложите клеточную суспензию в двухмиллилитровую трубку и центрифугируют клетки в течение 10 минут в 120 раз больше G.Отбросьте супернатант и повторно суспендьте клетки в двух миллилитрах полной среды. Посейте 0,32 миллиона клеток на лунку в шести луночную пластину в трех миллилитрах полной среды. Поместите пластину в инкубатор и культивируете ее при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Чтобы изолировать клетки RPE, удаляют стекловидное тело и сетчатку из заднего сегмента щипцами. Избегайте повреждения пигментного эпителия сетчатки. Вымойте лампочку PBS.
После подготовки обоих глаз наполните луковицу трипсином примерно на три четверти и высиживание в течение 25 минут при 37 градусах Цельсия крышкой чашки Петри поверх глазка луковицы. Удалите трипсин и добавьте один миллилитр полной среды. С помощью изогнутой, отполированной огнем пипетки Пастера удалите ячейки RPE.
Соберите клеточную суспензию внутри колбы и переложите ее в трубку размером 1,5 миллилита для повторного суспензии. Центрифугируют клетки в течение 10 минут при 120 разах G.Seed 0,32 млн клеток на лунку в шести лунке пластины в трех миллилитрах полной среды. Поместите пластину в инкубатор и культивируете ее при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Культивирует клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в увлажненный инкубатор. Через три-четыре дня пипетку вверх и вниз, чтобы собрать неприлипание клетки и положить половину объема в другой колодец. Наполните лунку до одного миллилитра полной средой.
Еще через три-четыре дня повторите сбор клеток, на этот раз объединив неприсоединяющиеся клетки из двух скважин в одну. Добавьте среду ко всем скважинам. Наблюдайте за клетками и меняйте среду два раза в неделю.
Когда клетки достигнут слияния, переключитесь на полную среду с 1% FBS. Используя вышеупомянутые протоколы, клетки IPE и RPE были успешно выделены и культивированы из пяти различных видов. Паттерн экспрессии RPE был подтвержден в первичных бытовых клетках IPE иммунофлуоресценцией для RPE65.
Жизнеспособность клеток изучали для исключения потенциальной токсичности электропорационного буфера с использованием коммерчески доступного набора для анализа цитотоксичности и электропорированного контроля узла. Никакого влияния на жизнеспособность клеток не наблюдалось. Прекультурные пигментные эпителиальные клетки разных видов были трансфекциированы желтым флуоресцентным белком Венеры.
Трансфекированные клетки RPE19 использовались в качестве положительного контроля. Здесь показана количественная оценка эффективности трансфекции в прекультурных свиноводческих RPE. Свежеизолированные пигментные эпителиальные клетки кролика были трансфекционны желтым флуоресцентным белком Венеры и контролировались с помощью микроскопии.
Пигментные эпителиальные клетки трансфектировали фактором, полученным из пигментного эпителия, а секреция белка контролировалась западным пятном. Сигнал для трансфекционных клеток был выше по сравнению с непереперераженными клетками для всех видов и дней исследования, и в течение этого времени не наблюдалось снижения секреции белка. Очень важно избегать соскабливания ячеек острыми инструментами.
Здесь используются огнеполированные пипетки Пастера, за исключением маленьких мышиных глаз, где необходимо использовать круглый скальпель. Пигментные эпителиальные клетки могут быть использованы для разработки подходов генной терапии и для моделирования патологических состояний, например, повреждения окислительным стрессом. Эти модели также могут быть использованы для тестирования терапевтических препаратов.
