Murine Ommaya, который имитирует резервуар Оммайя, используемый клинически, позволяет исследователям тестировать различные прямые целевые методы лечения метастазов в мозг и повсеместно смертельных лептоменингеальных заболеваний в доклинической модели. Преимущество этого метода заключается в том, что исследователи могут доставлять микролитровый объем лекарств непосредственно в спинномозговую жидкость для лечения метастазов в центральной нервной системе, минуя гематоэнцефалический барьер. Этот протокол имплантации Murine Ommaya предназначен для исследователей или техников, которые имеют опыт стереотаксической хирургии и обучение асептической технике, которые необходимы для обеспечения успеха этой процедуры.
Продемонстрировать процедуру будут Марджи Болдуин и Мишель Дэниелсон из сравнительной медицины в Университете Южной Флориды, а также Винсент Лоу, старший научный сотрудник лаборатории доктора Питера Форсайта в Онкологическом центре и научно-исследовательском институте Моффитта. Начните с инъекции мышам подкожно с одним миллиграммом на килограмм бупренорфина с замедленным высвобождением. После обезболивания мыши подготовьте ее к операции.
Обрежь хирургическое место с достаточной площадью границы, чтобы мех не загрязнял место разреза. Сбрить мех всей поверхности головы, и подготовить кожу с помощью стерильной техники. Затем насытить участок бактерицидным антисептиком для кожи, работающим от центра участка до периферии, и дать ему высохнуть.
Расположите тело, чтобы позвоночник поддерживался на одном уровне с cisterna magna. Прикладывая небольшое сцепление с хвостом, поместите ленту у основания хвоста, чтобы закрепить его. Нанесите либо стерильную драпировку, либо стерильный пластиковый драпировочный материал с адгезионной основой, чтобы защитить место операции от загрязнения.
Полностью разгибая шею, протяните кончики хирургических ножниц вниз с небольшим давлением через затылочную кость, начиная только между щепами. Сделайте небольшой трех-пятимиллиметровый разрез средней линии, немного выше пальпированной вогнутости. Втяни пять микролитров клеточной суспензии в шприц Гамильтона 30 калибра.
Используйте тупые щипцы с одним-двумя миллиметровыми наконечниками, чтобы осторожно надавить на цистерну magna. Введите наконечники в закрытое положение, и откройте их, применяя нисходящее давление на дыбачную оболочку. Повторяйте тупое рассечение до тех пор, пока дуральная мембрана не будет легко идентифицирована и связанные с ней кровеносные сосуды не будут видны в открытой области.
Удерживая щипцы открытыми, чтобы втянуть окружающую мускулатуру, введите иглу 30 калибра без корочника под твердое мозговое расстояние, чтобы визуализировать скос, убедившись, что игла вводится только сразу за сам скос. Медленно разверните шприцевой поршень и доставьте ячейки чуть ниже твердой мозговой оболочки. Если в месте инъекции отмечается утечка, нанесите мягкое давление с помощью аппликатора с хлопковым наконечником.
Закройте кожу, нанеся раневой зажим или микро каплю кожного клея. Наследуйте за мышами ежедневно после операции в течение первой недели. Если мышь испытывает боль или дистресс, лечите ее подкожной инъекцией 10 миллиграммов на килограмм карпрофена один раз в 12-24 часа в течение пяти дней на основе ветеринарной консультации и директивы.
Соберите инжекторное устройство Murine Ommaya с помощью миниатюрного инжекционного порта 25 калибра и одномиллиметрового проставочного диска. Используйте цианоакрилатный стерильный клей, чтобы обеспечить проникновение примерно 2,5 миллиметров металлической канюли в правое полушарие головного мозга, и подготовьте кожу по стерильной технике. Сделайте небольшой разрез кожи с последующим тупым рассечением подлежащих подкожных тканей, чтобы обнажить череп.
Высушите череп с помощью пропитанных перекисью водорода аппликаторных палочек с хлопковым наконечником. Просверлите отверстие 0,9 мм в черепе 0,5 миллиметра с задней стороны и 1,1 миллиметра боковой от брегмы, чтобы обнажить твердое вещество. Отодвиньте микродрень в сторону и аккуратно забивите кость, непосредственно окружающую отверстие заусенцев.
Прикрепите инъекционный порт к черепу с помощью цианоакрилатного стерильного клея и вставьте его на глубину примерно 2,5 миллиметра. Зашить разрез с помощью 4-0 нерассасывающихся нейлоновых швов в прерываемом рисунке стежка или пушкового шва. Размещайте послеоперационных мышей в отдельных клетках для выздоровления.
Чтобы дозировать мышь, получите доступ к Murine Ommaya с помощью адаптера для впрыска порта и шприца Hamilton. Используя щипцы, удерживайте верхнюю часть миниатюрного порта впрыска и аккуратно вставьте адаптер инжектора порта полностью в перегородку порта. После того, как инъекция сделана, отсоедините Murine Ommaya от адаптера впрыска порта с помощью щипцов.
С целью визуализации маршрута инъекции 2% Эванс Блю был введен через модель Murine Ommaya. Краситель успешно проник в желудочки и мозг за 15 минут. Через 30 минут краситель стал виден на спинном мозге.
В качестве доказательства концепции мышам BALB/c вводили меченую люциферазу линию клеток рака молочной железы Her2+TUBO внутричерно, и имплантировали Murine Ommayas. Примерно через неделю после инъекции у мышей начала развиваться LMD. Этих мышей лечили один раз в неделю в течение четырех недель иммунотерапией антител Her2, либо через системную терапию с помощью внутрибрюшинной инъекции, либо интратекально через мышиную оммайю.
В то время как необработанные мыши умерли к 19-му дню, все мыши, которые получили интратекальную терапию через Мышиную Оммайю, выжили. К четвертой неделе наблюдалась полная регрессия опухолей. По сравнению с мышами, получавших системную терапию, мыши, получавших интратекальную терапию, имели гораздо более длительную общую выживаемость.
При попытке этой процедуры важно, чтобы череп был сухим перед размещением мышиной оммайи. Используйте небольшое количество клея и позиционируйте Мышиную Оммайю в течение примерно 10 секунд, чтобы прилипнуть к черепу. С помощью этого метода исследователи могут исследовать широкий спектр лекарств от рака на мышиных моделях, которые клинически значимы для разработки рациональных терапевтических стратегий для пациентов с метастазированием в центральную нервную систему.
