Das Murine Ommaya, das das klinisch verwendete Ommaya-Reservoir nachahmt, ermöglicht es Forschern, eine Vielzahl von direkten gezielten Therapien für Hirnmetastasen und universell tödliche Leptomeningealerkrankungen in einem präklinischen Modell zu testen. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass Forscher ein Mikrolitervolumen von Medikamenten direkt in die Zerebrospinalflüssigkeit abgeben können, um Metastasen des zentralen Nervensystems zu behandeln und die Blut-Hirn-Schranke zu umgehen. Dieses Murine Ommaya Implantationsprotokoll wurde für Forscher oder Techniker entwickelt, die über stereotaktische Operationserfahrung und aseptisches Techniktraining verfügen, die für den Erfolg dieses Verfahrens unerlässlich sind.
Margie Baldwin und Michelle Danielson von der Comparative Medicine an der University of South Florida und Vincent Law, ein leitender wissenschaftlicher Mitarbeiter aus Dr. Peter Forsyths Labor am Moffitt Cancer Center and Research Institute, werden das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie, indem Sie der Maus subkutan ein Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung injizieren. Nachdem Sie die Maus betäubt haben, bereiten Sie sie auf die Operation vor.
Schneiden Sie die Operationsstelle mit genügend Randbereich ab, um zu verhindern, dass das Fell die Inzisionsstelle kontaminiert. Rasieren Sie das Fell der gesamten Oberfläche des Kopfes und bereiten Sie die Haut mit steriler Technik vor. Dann sättigen Sie die Stelle mit keimtötendem Hautantiseptikum, arbeiten Sie von der Mitte der Stelle bis zur Peripherie und lassen Sie sie trocknen.
Positionieren Sie den Körper, um sicherzustellen, dass die Wirbelsäule auf Höhe der Cisterna Magna gehalten wird. Legen Sie bei leichter Traktion auf das Heck Klebeband an die Heckbasis, um es zu sichern. Tragen Sie entweder einen sterilen Vorhang oder ein steriles, mit Klebstoff versehenes Kunststoffvorhangmaterial auf, um die Operationsstelle vor Verunreinigungen zu schützen.
Mit dem Hals in voller Ausdehnung, führen Sie die chirurgische Scherespitzen mit leichtem Druck über den Okzipitalknochen nach unten, beginnend direkt zwischen den Pinnae. Machen Sie einen kleinen Drei- bis Fünf-Millimeter-Mittellinienschnitt, etwas oberhalb der palpierten Konkavität. Ziehen Sie fünf Mikroliter der Zellsuspension in eine Hamilton-Spritze mit 30 Gauge.
Verwenden Sie eine stumpfe Spitze mit einer Spitze von ein bis zwei Millimetern, um sanft auf die Cisterna Magna zu drücken. Führen Sie die Spitzen in einer geschlossenen Position ein und öffnen Sie sie, während Sie Druck auf die Dura ausüben. Wiederholen Sie die stumpfe Dissektion, bis die Duralmembran leicht zu identifizieren ist und die zugehörigen Blutgefäße im exponierten Bereich sichtbar sind.
Während Sie die Zöge offen halten, um die umgebende Muskulatur zurückzuziehen, führen Sie eine 30-Gauge-Nadel ein, die nicht entkernt ist, um die Fase zu visualisieren, und stellen Sie sicher, dass die Nadel nur direkt hinter der Fase selbst eingeführt wird. Setzen Sie langsam einen Spritzenkolben ein und liefern Sie Zellen direkt unter der Dura. Wenn eine Leckage an der Injektionsstelle festgestellt wird, drücken Sie sanften Druck mit einem Applikator mit Baumwollspitze aus.
Schließen Sie die Haut, indem Sie einen Wundclip oder einen Mikrotropfen Hautkleber auftragen. Überwachen Sie die Mäuse täglich nach der Operation für die erste Woche. Wenn eine Maus Schmerzen oder Leiden zu haben scheint, behandeln Sie sie mit einer subkutanen Injektion von 10 Milligramm pro Kilogramm Carprofen einmal alle 12 bis 24 Stunden für bis zu fünf Tage basierend auf tierärztlicher Beratung und Anweisung.
Montieren Sie das Murine Ommaya Injektionsgerät mit einem 25 Gauge Miniatur-Injektionsanschluss und einer Ein-Millimeter-Abstandsscheibe. Verwenden Sie einen sterilen Cyanacrylat-Klebstoff, um das Eindringen von etwa 2,5 Millimetern der Metallkanüle in die rechte Gehirnhemisphäre zu gewährleisten, und bereiten Sie die Haut nach steriler Technik vor. Machen Sie einen kleinen Hautschnitt, gefolgt von einer stumpfen Dissektion des darunter liegenden Unterhautgewebes, um den Schädel freizulegen.
Trocknen Sie den Schädel mit wasserstoffperoxidgetränkten Applikatorstäbchen mit Baumwollspitze. Bohren Sie ein 0,9 Millimeter großes Gratloch in den Schädel 0,5 Millimeter posterior und 1,1 Millimeter seitlich der Bregma, um die Dura-Materie freizulegen. Bewegen Sie den Mikrobohrer zur Seite und schneiden Sie den Knochen, der das Gratloch unmittelbar umgibt, vorsichtig ab.
Befestigen Sie einen Injektionsanschluss mit einem sterilen Cyanacrylatkleber am Schädel und führen Sie ihn bis zu einer Tiefe von etwa 2,5 Millimetern ein. Nähen Sie den Schnitt mit 4-0 nicht resorbierbaren Nylonnähten in einem unterbrochenen Stichmuster oder einer Handtaschennaht. Beherbergen Sie mäuse nach der Operation in einzelnen Käfigen zur Genesung.
Um die Maus zu dosieren, greifen Sie mit einem Port-Injektionsadapter und einer Hamilton-Spritze auf die Murine Ommaya zu. Halten Sie mit einer Zette die Oberseite des Miniatur-Injektionsanschlusses und setzen Sie den Port-Injektoradapter vorsichtig vollständig in das Port-Septum ein. Sobald die Injektion erfolgt ist, lösen Sie die Murine Ommaya mit einer Zette vom Port-Injektionsadapter.
Zur Visualisierung des Injektionsweges wurden 2% Evans Blue über das Murine Ommaya-Modell injiziert. Der Farbstoff infiltrierte erfolgreich die Ventrikel und das Gehirn in 15 Minuten. Nach 30 Minuten wurde der Farbstoff am Rückenmark sichtbar.
Als Proof of Concept wurden BALB/c-Mäusen intrastern eine Luciferase-markierte Her2+TUBO-Brustkrebszelllinie injiziert und die Murine Ommayas implantiert. Etwa eine Woche nach der Injektion begannen die Mäuse LMD zu entwickeln. Diese Mäuse wurden einmal pro Woche für bis zu vier Wochen mit einer Her2-Antikörper-Immuntherapie behandelt, entweder durch systemische Therapie durch intraperitoneale Injektion oder intrathekal über die Murine Ommaya.
Während unbehandelte Mäuse am 19. Tag starben, überlebten alle Mäuse, die eine intrathekale Therapie durch die Murine Ommaya zurückzogen. In der vierten Woche wurde eine vollständige Regression von Tumoren beobachtet. Im Vergleich zu Mäusen, die mit systemischer Therapie behandelt wurden, hatten Mäuse, die eine intrathekale Therapie erhielten, ein viel längeres Gesamtüberleben.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, dass der Schädel trocken ist, bevor Sie die Murine Ommaya platzieren. Verwenden Sie eine kleine Menge Klebstoff und positionieren Sie die Murine Ommaya für etwa 10 Sekunden, um am Schädel zu haften. Mit dieser Technik können Forscher eine breite Palette von Krebsmedikamenten in Mausmodellen untersuchen, die klinisch relevant sind, um rationale therapeutische Strategien für Patienten mit Metastasen des zentralen Nervensystems zu entwickeln.
