Для электроантенографии использование комаров в определенном и постоянном физиологическом статусе имеет решающее значение для получения надежных результатов. Пошаговый протокол позволяет проводить длительные электроантеннографические записи у комаров. Метод может быть использован у нескольких видов комаров, причем как у самцов, так и у самок.
Электроантеннографический метод также может быть перенесен на другие модели насекомых, включая жуков, мух, целующихся жуков и муравьев. Для начала извлеките 1,5-миллилитровые янтарные флаконы, содержащие смеси одорантов и средство для контроля растворителей, из морозильной камеры при температуре 20 градусов Цельсия, в которой они хранятся, чтобы предотвратить разложение. Затем нанесите пипеткой 10 микролитров раствора одоранта на лист фильтровальной бумаги, загруженный внутрь стеклянного шприца с маркировкой.
Изолируйте комаров в день эксперимента. Работая под микроскопом, аккуратно разорвите кончик двух боросиликатных капилляров нитями с помощью пары щипцов. Перед проведением электроантеннографии или эксперимента EAG убедитесь, что держатели электродов чистые внутри, без боросиликатного мусора.
Затем выполняют хлорирование, замачивая серебряные провода электрододержателей в чистом отбеливателе в течение пяти минут, пока провода не станут темными, матово-серыми. Затем промойте провода. Ослабьте резиновую пробку и с помощью иглы 20 калибра заполните внутреннюю часть капилляра физиологическим раствором.
Промойте капилляры и вставьте провода в два капилляра. Держите кончик проволоки на расстоянии менее одного миллиметра от кончика капилляра. Пропустите капилляр через резиновое кольцо внутри держателя электрода, не разрывая его, и осторожно затяните резиновую пробку, убедившись, что пузырьки воздуха отсутствуют.
Используйте капилляр с более широким отверстием на держателе электрода сравнения и меньшим отверстием на держателе записывающего электрода. Оставьте два установленных держателя электродов на влажной чистящей салфетке, чтобы предотвратить высыхание наконечника до тех пор, пока он не будет готов к установке головки. Убедитесь, что воздушный стол поднят.
В авиакомпании нет засоров, и воздух включен. Убедитесь, что бак медицинского воздуха полон, чтобы не менять его в середине эксперимента, и подтвердите наличие пузырьков в увлажнителе. Включите компьютеры, программные приложения и блок питания клапана.
После проверки подключения к Интернету подайте управляющий импульс, чтобы убедиться, что клапан, подающий импульсы, работает. Положите алюминиевую пластину на лед, наложив на нее кусочек влажной чистящей салфетки и положите в угол небольшую ложку электродного геля. Поставьте противомоскитную чашку на лед, чтобы комар остыл.
Обрежьте кончик каждой антенны комара микроножницами. Используйте щипцы, чтобы протащить комара рядом с ложкой электродного геля, и аккуратно окуните кончик каждой антенны в гель. С помощью щипцов вытащите усики комара, при этом удерживая их рядом друг с другом.
Отрубите голову комара с помощью микроножниц. Аккуратно окуните кончик электрода сравнения в гель и поместите его в контакт с шеей, позволяя головке прилипнуть к нему. Поместите электрод опорной головки на микроманипулятор.
Подключите оба электрододержателя к усилителю. С помощью микроманипулятора расположите записывающий электрод как можно ближе к наконечникам антенны. Затем вставьте наконечники антенны в записывающий электрод.
Поместите трубку авиакомпании близко к заготовке головы комара на один сантиметр. Включите усилитель и шумоподавление и убедитесь, что базовый сигнал не зашумлен. Как только уровень шума станет удовлетворительным, вставьте первый шприц с запахом в отверстие авиакомпании, чтобы провести тест и закрыть клетку Фарадея.
Затем нажмите кнопку записи в программном обеспечении EAG, чтобы доставить импульс. Измерьте отклики EAG как амплитуду в милливольтах, а затем перейдите к следующему запаху или концентрации. Эксперимент успешно демонстрирует, что виды комаров могут проявлять различные обонятельные реакции на различные химические вещества.
Отсутствовала реакция на минеральное масло, которое использовалось в качестве отрицательного контроля. Погрешность в результатах из-за электрических помех может быть уменьшена путем заземления элементов в клетку Фарадея с помощью зажимов типа «крокодил». Порог реакции на один и тот же одорант может различаться по величине для разных видов комаров.
Например, комары Toxorhynchites rutilus septentrionalis производят очень большие EAG по сравнению с Aedes aegypti, Anopheles stephensi и Culex quinquefasciatus. Было замечено большое отклонение в ответ на положительный контроль, бензальдегид. В то время как отсутствовала реакция на отрицательный контроль, минеральное масло.
Эти средние отклики антенн показаны на гистограмме. Кроме того, порог обнаружения конкретного химического вещества для каждого вида комаров был определен путем представления антенны, увеличения концентрации химического вещества и построения кривой реакции на дозу. Важно начать запись как можно скорее после того, как голова была нарезана и установлена, чтобы обеспечить большую отзывчивость препарата.
ЭАГ позволяет определить, реагируют ли усики комара на данное химическое вещество в заданной концентрации. Однако это не позволяет определить баланс этого химического вещества. Например, будь то аттрактант или покаяние.
