Per l'elettroantennography, l'utilizzo di zanzare in uno stato fisiologico specifico e coerente è fondamentale per ottenere risultati affidabili. Il protocollo passo-passo consente registrazioni elettroantennografiche durature nelle zanzare. Il metodo può essere utilizzato in diverse specie di zanzare e sia nei maschi che nelle femmine.
La tecnica elettroantennografica può anche essere trasposta ad altri modelli di insetti, tra cui coleotteri, mosche, insetti bacianti e formiche. Per iniziare, rimuovere le fiale ambrate da 1,5 millilitri contenenti le miscele di odori e un controllo del solvente dal congelatore a 20 gradi Celsius in cui sono conservate per prevenire la degradazione. Quindi, pipettare 10 microlitri della soluzione odorante su un pezzo di carta da filtro caricato all'interno di una siringa di vetro etichettata.
Isolare le zanzare il giorno dell'esperimento. Lavorando al microscopio, rompere delicatamente la punta di due capillari borosilicati con filamenti usando un paio di pinze. Prima di eseguire l'elettroantennography, o esperimento EAG, assicurarsi che i supporti degli elettrodi siano liberi all'interno, senza detriti di borosilicato.
Quindi eseguire la cloridizzazione immergendo i fili d'argento dei supporti degli elettrodi in pura candeggina per cinque minuti, fino a quando i fili diventano scuri, grigio opaco. Quindi risciacquare i fili. Allentare il tappo di gomma e utilizzare un ago da 20 gauge per riempire l'interno del capillare con soluzione salina.
Risciacquare i capillari e inserire i fili nei due capillari. Mantenere la punta del filo a meno di un millimetro dalla punta del capillare. Far passare il capillare attraverso l'anello di gomma all'interno del supporto dell'elettrodo senza romperlo e stringere delicatamente il tappo di gomma, dopo aver verificato che non siano presenti bolle d'aria.
Utilizzare il capillare con l'apertura più ampia sul supporto dell'elettrodo di riferimento e l'apertura più piccola sul supporto dell'elettrodo di registrazione. Lasciare i due supporti per elettrodi montati su una salvietta per la pulizia a umido per evitare che la punta si asciughi fino al momento di montare la testa. Assicurarsi che la tabella dell'aria sia sollevata.
Non c'è alcun blocco nella compagnia aerea e l'aria è accesa. Verificare che il serbatoio di aria medica sia pieno per evitare di cambiarlo nel mezzo dell'esperimento e confermare le bolle nell'umidificatore. Accendere i computer, le applicazioni software e l'alimentatore della valvola.
Dopo aver verificato la connessione Internet, erogare un impulso di controllo per verificare che la valvola che eroga gli impulsi sia funzionante. Posizionare una piastra di alluminio sul ghiaccio con un pezzo di salvietta per la pulizia umida su di esso e mettere una piccola cucchiaiata di gel per elettrodi in un angolo. Metti una tazza di zanzara sul ghiaccio per far raffreddare la zanzara.
Tagliare la punta di ogni antenna della zanzara con micro forbici. Utilizzare una pinza per trascinare la zanzara vicino all'elettrodo gel dollop e immergere delicatamente la punta di ciascuna antenna nel gel. Usando una pinza, estrai le antenne delle zanzare, mantenendoli uno accanto all'altro.
Tritare la testa della zanzara usando micro forbici. Immergere delicatamente la punta dell'elettrodo di riferimento nel gel e metterlo a contatto con il collo, lasciando che la testa si attacchi ad esso. Posizionare l'elettrodo della testa di riferimento su un micro manipolatore.
Collegare entrambi i supporti degli elettrodi all'amplificatore. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare l'elettrodo di registrazione il più vicino possibile alle punte dell'antenna. Quindi inserire le punte dell'antenna nell'elettrodo di registrazione.
Posizionare il tubo della compagnia aerea vicino alla preparazione della testa di zanzara, a un centimetro. Accendere l'amplificatore e il riduttore di rumore e assicurarsi che il segnale di base non sia rumoroso. Una volta che il livello di rumore è soddisfacente, inserire la prima siringa antiodore nel foro dell'aria per eseguire il test e chiudere la gabbia di Faraday.
Quindi fare clic su registra sul software EAG per erogare l'impulso. Misurare le risposte EAG come ampiezza in millivolt e quindi procedere con l'odore o la concentrazione successiva. L'esperimento dimostra con successo che le specie di zanzare possono esibire risposte olfattive variabili a diverse sostanze chimiche.
C'era un'assenza di risposta all'olio minerale, che è stato usato come controllo negativo. L'errore nei risultati dovuto al rumore elettrico può essere ridotto mettendo a terra gli elementi nella gabbia di Faraday, utilizzando clip a coccodrillo. La soglia di risposta allo stesso odorante può variare in grandezza per diverse specie di zanzare.
Ad esempio, le zanzare Toxorhynchites rutilus septentrionalis producono EAG molto grandi, rispetto ad Aedes aegypti, Anopheles stephensi e Culex quinquefasciatus. È stata notata una grande deflessione in risposta al controllo positivo, la benzaldeide. Mentre c'era una mancanza di risposta al controllo negativo, olio minerale.
Queste risposte medie antennali sono mostrate in un diagramma a barre. Inoltre, la soglia di rilevamento di una sostanza chimica specifica per ciascuna specie di zanzara è stata determinata presentando l'antenna, le concentrazioni crescenti della sostanza chimica e tracciando una curva dose-risposta. È importante iniziare la registrazione il prima possibile dopo che la testa è stata tagliata e montata, per garantire una grande reattività della preparazione.
L'EAG consente di determinare se le antenne delle zanzare rispondono a una determinata sostanza chimica a una determinata concentrazione. Tuttavia, non consente di determinare l'equilibrio di questa sostanza chimica. Ad esempio, se si tratta di un attrattivo o di un pentimento.
