Этот протокол обеспечивает эффективную изоляцию и культуру клеток RPE мыши. Здоровые первичные культуры RPE мыши являются ценными моделями для понимания механизмов основных заболеваний глаз. Слияние и жизнеспособные культуры RPE получить в течение трех дней и могут быть выращены в течение нескольких недель.
Этот протокол был успешно использован для понимания механизмов, лежащих в основе ранней возрастной макулярной дегенерации, которая является основной причиной слепоты среди пожилых людей в развитых странах. Важно визуализировать шаги вскрытия. Детали имеют решающее значение для успеха протокола, например, как обращаться с глазными яблоками, так что склера не ударил, где именно сокращения должны быть выполнены, и как вставлять чашки глаз в трипсин, чтобы они остаются открытыми.
Начните с подготовки всех необходимых реагентов для протокола. Затем начните очистку глазного яблока, тщательно удаляя все соединительной ткани, крови и мышц, используя Дюмон номер пять типсов и угловые ножницы, не делая никаких порезов в склере. Передача глазного яблока на свежее блюдо, содержащее три миллилитров буфера HBSS без HEPES, чтобы держать глаз свежим и чистым и избежать загрязнения.
Используйте зрительный нерв в качестве ручки, чтобы держать глазное яблоко и сделать отверстие в центре роговицы с острым лезвием стали углерода 11. Сделайте три разреза роговицы через отверстие с дюмоном номер пять ножницами, гарантируя, что есть достаточно места, чтобы удалить объектив. Держите зрительный нерв и применить небольшое давление на ора серрата с основанием угловых ножниц, пока объектив выходит полностью.
Держите эпителий радужной оболочки нетронутыми, чтобы предотвратить отслоение нервной сетчатки и RPE во время инкубации. Поместите глаз в буфер HBSS без HEPES. Инкубировать глаза без линз в растворе гиалуронидазы при 37 градусах по Цельсию в течение 45 минут в 5%-х углекислом газе аэрированном инкубаторе, чтобы отделить нервную сетчатку от RPE.
Поместите каждый глаз в новую колодец с 1,5 миллилитров холодного буфера HBSS HEPES на колодец и инкубировать его на льду в течение 30 минут. После мытья поместите каждый глаз в 35-миллиметровое блюдо культуры со свежим буфером HBSS HEPES. Вырезать роговицу через оригинальные разрезы с восьми сантиметров Vannas ножницами, пока ора серрата не будет достигнута, а затем сократить ниже ора серрата, чтобы удалить эпителий радужной оболочки глаза и роговицы.
Держите серрату оры изогнутыми пинцетами и используя угловые микротяги, ототяните нервную сетчатку, убедившись, что слой RPE не разрезан. Затем, сократить внутреннее присоединение к зрительного нерва. Вырезать зрительный нерв и передать каждый глаз чашку на различные 12 хорошо пластины, содержащей 1,5 миллилитров свежего трипсина-ЭДТА на колодец.
Убедитесь, что глаз чашки остаются открытыми и полностью погружены в трипсин. Инкубировать чашки для глаз при 37 градусах по Цельсию в течение 45 минут в инкубаторе с 5%-ным углекислым газом. Соберите каждую чашку глаза вместе с любыми листами RPE, отделенными во время инкубации трипсина, и перенесите их в 12 хорошо пластин, содержащих 1,5 миллилитров раствора FBS на колодец.
Если листы RPE остаются в растворе трипсина, используйте микропайпетт для передачи их в колодец с раствором FBS. Держите каждую чашку глаза зрительным нервом и встряхните ее лицом вниз в 12 хорошо пластины, содержащей 1,5 миллилитров 20%FBS в буфере HBSS HEPES до полного отслоения листов RPE достигается. Соберите любые листы RPE и кластеры RPE с помощью микропипетта, избегая любых белых кусочков склеры или хороида, которые могут загрязнять культуры, и поместить их в 15 миллилитровую трубку.
Вытяните два глаза от одной и той же мыши в одной трубке. Затем центрифуга смеси RPE при температуре 340 х г в течение двух минут при комнатной температуре и отбросить супернатант. Аккуратно повторно посвоить гранулы RPE в одной миллилитровой смеси 0,25%трипсина-ЭДТА и инкубировать его в течение одной минуты в водяной бане при 37 градусах по Цельсию, чтобы дезагрегировать листы RPE в одиночные клетки.
Затем аккуратно пипетки вверх и вниз 10 раз, избегая образования пузырьков. Добавьте девять миллилитров свежеприготовленной среды RPE, чтобы разбавить и инактивировать трипсин и центрифугу смеси при температуре 340 х г в течение двух минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант и тщательно повторно помыть клеточные гранулы в 150 микролитров RPE среды с 5%FBS.
Затем удалите PBS из нижней камеры ранее подготовленной мембранной вставки с покрытием ламинина и добавьте к ней 700 микролитров среды RPE. Удалите ламинин из верхней камеры мембранной вставки и распредельте подвеску RPE-клетки капли-мудрый и равномерно к центру камеры. Поместите мембрану вставить спокойно в 5%carbon dioxide инкубатор при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере 24 часов.
Затем проверьте мембранную вставку под микроскопом, чтобы убедиться, что большинство клеток RPE прикреплены к вставке и слияние, по крайней мере 50%Не меняйте средства массовой информации в течение первых 72 часов. RpE клетки изолированы с помощью этого протокола показали типичный размер RPE, морфология, и пигментации. Через неделю наблюдался высокополяризованный монослой RPE с двумя ядрами, соединенными плотными соединениями, а также наличием апических микровилли и базальных вложения.
Поляризация монослой RPE была подтверждена значениями TER, при этом средний показатель был выше 200 охм сем в квадрате, который оставался стабильным с течением времени. При фагоцитозных анализах, выполненных на FITC с маркировкой крупного рогатого скота POS, наблюдалось поглощение и переваривание POS, что указывает на образование функционального стечения монослоя клеток RPE. Жизнеспособные культуры требуют короткого времени вскрытия, которое достигается с опытом.
Некоторые клетки RPE могут оставаться прикрепленными к нервной сетчатке, но если несколько листов RPE остаются прикрепленными, протокол не увенчается успехом. Свежие гиалуронидазы должны быть использованы каждый раз, чтобы предотвратить эту проблему. Эти функциональные первичные культуры клеток мыши RPE являются ценным инструментом для изучения патобиологии RPE во многих глазных заболеваний.
Например, этот протокол дал возможность изучить патобиологию RPE в мышиной модели макулярной дегенерации.
