Bu protokol, fare RPE hücrelerinin verimli bir şekilde yalıtılıp kültüre sahip olduğunu sağlar. Sağlıklı birincil fare RPE kültürleri, alttaki göz hastalıklarının mekanizmalarını anlamak için değerli modellerdir. Birleştiğinde ve uygulanabilir RPE kültürleri üç gün içinde elde edilir ve haftalarca yetiştirilebilir.
Bu protokol, gelişmiş ülkelerde yaşlılar arasında körlüğün önde gelen nedeni olan erken yaşa bağlı makula dejenerasyonu altında kalan mekanizmaları anlamak için başarıyla kullanılmıştır. Diseksiyon adımlarını görselleştirmek önemlidir. Ayrıntılar protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir, örneğin skleranın yumruklanmaması için göz kürelerinin nasıl ele alınacağı, tam olarak nerede kesiklerin yapılması gerektiği ve göz kapaklarının açık kalacak şekilde tripsin içine nasıl gömüleceği.
Protokol için gerekli tüm reaktifleri hazırlamakla başlayın. Ardından, sklerada herhangi bir kesik yapmadan Dumont beş numaralı periptüs ve açılı makas kullanarak tüm bağ dokusunu, kanı ve kasları dikkatlice çıkararak göz küresini temizlemeye başlayın. Gözü temiz ve temiz tutmak ve herhangi bir kirlenmeyi önlemek için göz küresini düzenli olarak üç mililitre HEPES içermeyen HBSS tamponu içeren taze bir tabağa aktarın.
Optik siniri göz küresini tutmak ve korneanın ortasında 11 numaralı keskin bir karbon çeliği ile bir delik açmak için bir tutamak olarak kullanın. Korneada dumont beş numaralı makasla delikten üç kesi yaparak lensi çıkarmak için yeterli alan olmasını sağlayın. Optik siniri tutun ve lens tamamen çıkana kadar açılı makasın tabanı ile ora serrataya hafif basınç uygulayın.
İnkübasyon sırasında nöral retina ve RPE'nin kopmasını önlemek için iris epitelini sağlam tutun. Gözü HEPES içermeyen HBSS tampona yerleştirin. Nöral retinayı RPE'den ayırmak için % 5 karbondioksit havalandırılmış inkübatörde 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede hyaluronidaz çözeltisinde lenssiz gözleri kuluçkaya yatırın.
Her gözü kuyu başına 1,5 mililitre soğuk HBSS HEPES tamponu ile yeni bir kuyuya yerleştirin ve 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Yıkadıktan sonra, her gözü taze HBSS HEPES tamponu ile 35 milimetrelik bir kültür yemeğine yerleştirin. Korneayı ora serrata ulaşılana kadar sekiz santimetre Vannas makası ile orijinal kesilerden kesin, ardından iris epitelini ve korneayı çıkarmak için ora serratanın altında kesin.
Ora serratayı kavisli cımbızla tutun ve açılı mikro önpsler kullanarak RPE tabakasının kesilmemesini sağlamak için sinir retinasını çekin. Daha sonra, optik sinire iç bağlanmayı kesin. Optik siniri kesin ve her göz kabını kuyu başına 1,5 mililitre taze tripsin-EDTA içeren farklı bir 12 kuyu plakasına aktarın.
Göz kapaklarının açık kaldığından ve tripsin'e tamamen batırıldığından emin olun. %5 karbondioksit inkübatöründe göz kapaklarını 37 santigrat derecede 45 dakika kuluçkaya yatırın. Her göz kabını trypsin inkübasyonu sırasında ayrılan RPE levhalarla birlikte toplayın ve kuyu başına 1,5 mililitre FBS çözeltisi içeren 12 kuyu plakasına aktarın.
RPE sayfaları tripsin çözeltisinde kalırsa, FBS çözümü ile kuyuya aktarmak için bir mikropipette kullanın. Her göz kabını optik sinirden tutun ve RPE levhalarının tamamen kopması elde edilene kadar HBSS HEPES tamponunda 1,5 mililitre%20 FBS içeren 12 kuyu plakasına yüzüstü sallayın. Kültürleri kirletebilecek beyaz sklera veya koroid parçalarından kaçınarak mikropipette ile herhangi bir RPE yaprağı ve RPE kümesi toplayın ve bunları 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.
Bir tüpte aynı fareden iki göz çekin. Ardından, RPE karışımını oda sıcaklığında iki dakika boyunca 340 x g'da santrifüjleyin ve süpernatantı atın. RPE peletini%0,25 trypsin-EDTA'nın bir mililitre karışımında hafifçe yeniden biriktirin ve RPE yapraklarını tek hücrelere ayırmak için 37 santigrat derecede bir su banyosunda bir dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra kabarcık oluşumunu önleyerek 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipet. Trypsin'i seyreltmek ve devre dışı bırakmak ve karışımı oda sıcaklığında iki dakika boyunca 340 x g'da santrifüj etmek için dokuz mililitre taze hazırlanmış RPE ortamı ekleyin. Süpernatantı emiş edin ve hücre peletini %5 FBS ile 150 mikrolitre RPE ortamında dikkatlice yeniden ıslatın.
Ardından, PBS'yi önceden hazırlanmış laminin kaplı membran kesici ucun alt haznesinden çıkarın ve içine 700 mikrolitre RPE ortamı ekleyin. Laminin'i membran kesici ucun üst odasından çıkarın ve RPE hücre süspansiyonunu damla açısından ve düzgün bir şekilde odanın ortasına dağıtın. Membran kesici ucu en az 24 saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit inkübatörüne bozulmadan yerleştirin.
Ardından, çoğu RPE hücresinin kesici uça bağlı olduğundan ve izdihamın en az%50 olduğundan emin olmak için mikroskop altındaki membran kesici ucu kontrol edin İlk 72 saat boyunca ortamı değiştirmeyin. Bu protokol kullanılarak yalıtılmış RPE hücreleri tipik RPE boyutunu, morfolojisini ve pigmentasyonunu gösterdi. Bir hafta sonra, apikal mikrovilli ve bazal infoldların varlığı ile birlikte sıkı kavşaklarla birleştirilen iki çekirdekli yüksek polarize bir RPE monolayer gözlendi.
RPE monolayer'in polarizasyonu TER değerleri tarafından doğrulandı ve ortalama 200 ohms santimetre kareden daha yüksekti ve bu da zaman içinde sabit kaldı. FITC etiketli sığır POS'unda yapılan fagositoz tahlillerinde, RPE hücrelerinin fonksiyonel bir birleştiği monolayer oluşumuna işaret eden POS'un yutulduğu ve sindirilmesi gözlendi. Yaşanabilir kültürler, deneyimle elde edilen kısa diseksiyon süresi gerektirir.
Bazı RPE hücreleri nöral retinaya bağlı kalabilir, ancak birkaç RPE sayfası takılı kalırsa, protokol başarılı olmaz. Bu sorunu önlemek için her zaman taze hyaluronidaz kullanılmalıdır. Bu fonksiyonel birincil fare RPE hücre kültürleri, birçok göz hastalığında RPE'nin patobiyolojisini incelemek için değerli bir araçtır.
Örneğin, bu protokol, RPE'nin patobiyolojisini bir fare modeli olan makula dejenerasyonunda incelemeyi mümkün kıldı.
