このプロトコルは、マウスRPE細胞の効率的な分離と培養を可能にします。健常なプライマリマウスRPE培養は、基礎となる眼疾患のメカニズムを理解するための貴重なモデルです。コンフルエントで実行可能なRPE培養は3日以内に取得し、数週間成長させることができます。
このプロトコルは、先進国の高齢者の失明の主な原因である早期加齢黄斑変性症のメカニズムを理解するためにうまく使用されています。解剖ステップを視覚化することが重要です。詳細は、プロトコルの成功には、例えば、眼球を扱って、クリンラがパンチしないようにする方法、正確にカットを行う場所、そして彼らが開いたままになるようにトリプシンにアイカップを埋め込む方法など、重要です。
プロトコルに必要なすべての試薬を準備します。次に、強切に切り傷をかけずに、デュモン番号5鉗子と斜めハサミを使用して、すべての結合組織、血液、筋肉を慎重に除去することによって眼球の洗浄を開始します。眼球を3ミリリットルのHEPESフリーHBSSバッファーを含む新鮮な皿に定期的に移して、目を新鮮で清潔に保ち、汚染を避けます。
眼球を保持し、鋭い炭素鋼番号11ブレードで角膜の中央に穴を開けるハンドルとして視神経を使用してください。デュモン番号5ハサミで穴を通して角膜に3つの切開を行い、レンズを取り外すのに十分なスペースがあることを確認します。視神経を保持し、レンズが完全に出てくるまで、斜めのはさみのベースで、オラ・コナラタにわずかな圧力を加えます。
インキュベーション中に神経網膜とRPEの剥離を防ぐために、虹彩上皮をそのままにしておきます。ヒューペスを含まないHBSSバッファに目を入れます。5%の二酸化炭素気泡インキュベーターで37°Cのヒアルロニダーゼ溶液中のレンズなしで目をインキュベートし、RPEから神経網膜を取り外します。
1.5ミリリットルの冷たいHBSS HEPESバッファーを備えた新しいウェルに各目を置き、氷の上で30分間インキュベートします。洗浄後、新鮮なHBSS HEPESバッファーを備えた35ミリメートルの培養皿に各目を入れます。オラ・コナラに達するまで8センチメートルのヴァンナスハサミで元の切開を通して角膜を切り、その後、虹彩上皮と角膜を取り除くために、オラ・セラタの下にカットします。
湾曲したピンセットでオラ・コナラを保持し、角度付きマイクロ鉗子を使用して、神経性のretinaを引き離し、RPE層が切断されないようにします。その後、視神経への内部付着を切断する。視神経を切断し、各アイカップを1.5ミリリットルの新鮮なトリプシン-EDTAを含む別の12ウェルプレートに移します。
アイカップが開いたままで、トリプシンに完全に沈んだままであることを確認してください。アイカップを摂氏37度で45分間5%の二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。トリプシンインキュベーション中に取り外されたRPEシートと一緒に各アイカップを収集し、ウェルあたり1.5ミリリットルのFBS溶液を含む12ウェルプレートに転送します。
RPEシートがトリプシン溶液に残っている場合は、マイクロピペットを使用してFBS溶液でウェルに転送します。視神経で各アイカップを保持し、RPEシートの完全な剥離が達成されるまで、HBSS HEPESバッファー内の20%FBSの1.5ミリリットルを含む12ウェルプレートに下に振ります。培養物を汚染する可能性のある白い部分の白い部分の白い部分を避け、15ミリリットルのチューブに入れて、マイクロピペットを使用してRPEシートとRPEクラスタを収集します。
1つのチューブで同じマウスから2つの目を引っ張ります。次いで、RPE混合物を室温で2分間340xgで遠心し、上清を捨てる。0.25%トリプシン-EDTAの1ミリリットルの混合物中にRPEペレットを穏やかに再懸濁し、37°Cの水浴で1分間インキュベートし、RPEシートを単一細胞に分解します。
その後、気泡の形成を避け、10回上下にピペットを穏やかに。作りたてのRPE培地を9ミリリットル加えて、トリプシンを希釈し、室温で2分間340 x gで遠心分離機を薄め、不活性化します。上清を吸引し、5%FBSで150マイクロリットルのRPE培地で細胞ペレットを慎重に再懸濁します。
次に、前に調製したラミニン被覆膜挿入物の底部チャンバーからPBSを取り出し、それに700マイクロリットルのRPE培地を加える。膜挿入物の上部チャンバーからラミニンを取り出し、RPE細胞の懸濁液をドロップワイズおよび均一にチャンバーの中央に分配する。膜挿入物を5%の二酸化炭素インキュベーターに37°Cで少なくとも24時間放置します。
次に、顕微鏡下の膜挿入物を調べて、ほとんどのRPE細胞が挿入物に取り付けられ、合流率が少なくとも50%であることを確認してください。このプロトコルを用いて単離されたRPE細胞は、典型的なRPEサイズ、形態、および色素沈着を示した。2つの核を持つ高度偏光RPE単層は、尖体マイクロビリと基底折りたたみの存在と共に、1週間後に観察された。
RPE単層の偏光はTER値で確認され、平均は200ωセンチメートルを超え、時間の経過とともに安定したままでした。FITC標識されたウシPOSに対して行われた貪食アッセイでは、POSの巻き込みおよび消化が観察され、RPE細胞の機能的コンフルエント単層の形成を示す。実行可能な文化は、経験を持つ短い解剖時間を必要とします。
一部の RPE 細胞は神経の残りの retina に接続されたままであっても、いくつかの RPE シートがアタッチされたままの場合、プロトコルは成功しません。新鮮なヒアルロンジダーゼは、この問題を防ぐために毎回使用する必要があります。これらの機能性プライマリマウスRPE細胞培養は、多くの眼疾患におけるRPEの病態生物学を研究するための貴重なツールである。
例えば、このプロトコルは、黄斑変性のマウスモデルにおけるRPEの病態生物学を研究することを可能にした。
