Расстройства, связанные с RPE, остаются основной частью смешивания заболеваний, но без эффективных остатков в виртуальной культуре первичных клеток RPE, чтобы служить хорошей моделью для физиологических и патологических исследований расстройств, связанных с RPE. В этом протоколе мы предоставляем простой в использовании протокол для культивирования первичных IPC, который может быстро восстанавливать и поддерживать более поздние характеристики RP, мы считаем, что с помощью этого метода люди могут быстро генерировать RP-клетки из исследований макистата и защитных скринингов лекарств, которые могут облегчить разработку нового лечения расстройств RPE. Пошаговая демонстрация значения значительно облегчит тиражирование этого метода в различных лабораториях, которые хотят изучить клетки RP.
Для начала разморозьте ткани пищеварительного ферментаmalaquad и стерилизуйте 1X PBS. Дополняют 2% пенициллином и 2% стрептомицином путем фильтрации раствора через 0,22-микрометровый шприцевой фильтрующий блок. Промывайте колодцы культуральной пластины и трансвеллеров с 1X PBS.
Удалите PBS из колодцев и трансвелл с помощью пипетки и добавьте один миллилитр свежего 1X PBS в нижнюю камеру и 600 микролитров по 10 микрограммов на миллилитр раствора ламинина в верхнюю камеру. Инкубируйте пластины и трансвеллеры в этом инкубаторе гелицикультуры в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. После этого удалите раствор ламината из верхней камеры и дважды промойте одним миллилитром холодного 1X PBS перед посадкой ячейки Очистите вытяжку с потоком ламината 75% этанолом и ультрафиолетовым светом.
Приготовьте три 50-миллилитровые стерильные центрифужные трубки, содержащие около 25 миллилитров 75% этанола, три 50-миллилитровые стерильные центрифужные трубки, содержащие около 25 миллилитров 1X PBS, и три 10-сантиметровые стерильные чашки для культивирования клеток, содержащие около 15 миллилитров 1X PBS. Замочите четыре глазных яблока свиней примерно в 15 миллилитрах 75% этанола в 10-сантиметровой чашке Петри и используйте ножницы и щипцы, чтобы отрезать все остаточные соединительные ткани и мышцы. Чтобы обеззаразить глазные яблоки, замачивайте и промывайте четыре глазных яблока в трех 50-миллилитрах стерильных центрифужных трубках, заполненных 75% этанолом последовательно.
Затем промыть глазные яблоки в трех 50-миллилитровых стерильных центрифужных трубках, заполненных 1X PBS последовательно. Переворачивайте трубки каждую минуту, чтобы тщательно промыть глазные яблоки. Переместите четыре глазных яблока в 10-сантиметровую стерильную чашку для культивирования клеток, содержащую 1X PBS.
Обрежьте внешнюю поверхность каждого глазного яблока еще раз, чтобы удалить зрительный нерв и мелкий мусор. С помощью ножниц сделайте небольшой разрез на пересечении лимбуса и склеры. А затем удалите роговицу, радужную оболочку, хрусталик, стекловидное тело и нервную сетчатку.
Переложите комплекс сосудистой оболочки RPE в новую 10-сантиметровую чашку для культивирования клеток и сделайте четыре разреза, чтобы плоская глазная чашка приобрела форму четырехлистного клевера. Выполняйте трипы в переваривании раствора ЭДТА, помещая четыре комплекса сосудистой склеры RPE в новую 10-сантиметровую посуду и заливая 20 миллилитров свежего трипсина раствором ЭДТА для слияния комплексов сосудистой оболочки RPE. Поместите блюдо в инкубатор клеточной культуры при температуре 37 градусов Цельсия на почти 30 минут.
Через 30 минут выньте блюдо из инкубатора и добавьте в блюдо 20 миллилитров предварительно теплой клеточной культуральной среды с 10% FBS. Для нейтрализации трипов в растворе ЭДТА используют пятимиллилитровую передаточную пипетку для диссоциации клеток RPE путем осторожного пипетирования несколько раз. Соберите клеточные суспензии в 15-миллилитровые центрифужные трубки, а затем аккуратно пипетку еще 10 миллилитров свежей питательной среды с помощью FBS, чтобы промыть комплексы склер RPE Choroids на посуде.
Соберите ячейки RPE путем центрифуги пробирок при 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирируйте суперагент с помощью пипетки и добавьте еще пять миллилитров культуральной среды с FBS для повторной приостановки клеток. Центрифуга при 300 G еще пять минут.
Декантировать суперагент и повторно приостановить клетки 12 миллилитрами питательной среды. Далее семена от 100 000 до 200 000 клеток на скважину в 12 луночных культуральных пластин или трансвелл-вкладышей. Меняйте питательные среды каждые два дня и снижайте концентрацию сыворотки до 1%, когда клетки полностью покрывают поверхность лунок на одну вставку.
Меняйте культуральную среду каждые два дня, пока клетки не будут собраны. Репрезентативные изображения первичных клеток RPE свиней на второй, шестой и 10-й день показаны здесь. QRTPCR-анализ уровней мРНК сигнатурных генов в первичных клетках RPE свиней, первичных клетках RPE человека, клетках ARPE 19 и сосудистой ткани RPE свиней обнаруживается с помощью этого графического изображения.
Здесь GAP DH использовался в качестве гена домашнего хозяйства для RTPCR. Четыре биологических репликата были использованы для первичных клеток RPE свиней и RPE 19 клеток, где три биологических репликата были использованы для первичных клеток RPE человека и свиной ткани RPE. Уровни экспрессии генов в клетках ARPE 19 были установлены в качестве контрольных.
На этом рисунке показан западный анализ крови белков RPE 65 в клетках ARPE 19 и porcine RPE и в первичных клетках RPE человека и тканях сосудистой оболочки RPE свиней. Винкулин использовался здесь в качестве регулятора нагрузки. На этом рисунке показана двухнедельная культура клеток RPE свиней в среде DMEM Basic с 1% FBS.
Клетки, культивируемые с Ламином или без него, окрашивали RPE 65, натриевыми калийными APTAs, Z01 и Hex. Измерения TR в клеточных листах, культивируемых с ламинином или без него, изображены на этом рисунке. На этом рисунке показан западный анализ крови на фактор роста эндотелия сосудов или ФАКТОР РОСТА VEGF и пигментного эпителия или PEDF в первичных клетках RPE и ARPE 19 свиней.
Секторальные функции культивируемых первичных клеток свиней RPE и ARPE 19 представлены на этих изображениях. Большая часть этого протокола заключается в растворении RP-клеток из глиальных комплексов RPE. Мы рекомендуем использовать свежие трипы и раствор каждый раз и правильно контролировать время пищеварения, чтобы растворить восемь клеток RP.
