Este protocolo permite el aislamiento eficiente y el cultivo de las células RPE del ratón. Los cultivos RPE de ratón primario sano son modelos valiosos para entender los mecanismos de las enfermedades oculares subyacentes. Las culturas RPE confluentes y viables se obtienen en un plazo de tres días y se pueden cultivar durante semanas.
Este protocolo se ha utilizado con éxito para comprender los mecanismos subyacentes a la degeneración macular relacionada con la edad temprana, que es la principal causa de ceguera entre los ancianos de los países desarrollados. Es importante visualizar los pasos de disección. Los detalles son críticos para el éxito del protocolo, por ejemplo, cómo manejar los globos oculares para que la esclera no se golpee, dónde se deben realizar exactamente los cortes y cómo incrustar las tazas de los ojos en la tripatina para que permanezcan abiertas.
Comience con la preparación de todos los reactivos necesarios para el protocolo. A continuación, comience a limpiar el globo ocular retirando cuidadosamente todo el tejido conectivo, la sangre y los músculos, utilizando fórceps dumont número cinco y tijeras en ángulo, sin hacer ningún corte en la esclerótica. Transfiera el globo ocular a un plato fresco que contenga tres mililitros de amortiguador HBSS libre de HEPES regularmente para mantener el ojo fresco y limpio y evitar cualquier contaminación.
Utilice el nervio óptico como mango para sostener el globo ocular y hacer un agujero en el centro de la córnea con una hoja de acero al carbono afilado número 11. Haga tres incisiones en la córnea a través del agujero con tijeras Dumont número cinco, asegurando que haya suficiente espacio para quitar la lente. Sujete el nervio óptico y aplique una ligera presión a la ora serrata con la base de las tijeras en ángulo, hasta que la lente salga por completo.
Mantenga intacto el epitelio del iris para evitar el desprendimiento de la retina neural y el RPE durante la incubación. Coloque el ojo en el búfer HBSS libre de HEPES. Incubar los ojos sin lentes en solución hialuronidasa a 37 grados Celsius durante 45 minutos en una incubadora aerada de dióxido de carbono al 5% para separar la retina neuronal del RPE.
Coloque cada ojo en un nuevo pozo con 1,5 mililitros de amortiguador HBSS HEPES frío por pozo e incubarlo en hielo durante 30 minutos. Después de lavar, coloque cada ojo en un plato de cultivo de 35 milímetros con un tampón HBSS HEPES fresco. Corta la córnea a través de las incisiones originales con tijeras Vannas de ocho centímetros hasta que se alcance la ora serrata, luego corta debajo de la ora serrata para eliminar el epitelio iris y la córnea.
Sostenga la ora serrata con pinzas curvas y usando micro fórceps en ángulo, tire de la retina neural, asegurándose de que la capa RPE no esté cortada. A continuación, corte el accesorio interno al nervio óptico. Corte el nervio óptico y transfiera cada taza de ojos a una placa de pozo diferente de 1,5 mililitros de trippsina fresca-EDTA por pozo.
Asegúrese de que las tazas de ojos permanezcan abiertas y completamente sumergidas en la triptina. Incubar las tazas oculares a 37 grados Celsius durante 45 minutos en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Recoge cada taza de ojos junto con cualquier hoja RPE desprendida durante la incubación de trypsin y transfiéralas a una placa de 12 pozos que contenga 1,5 mililitros de solución FBS por pozo.
Si las hojas RPE permanecen en la solución trypsin, utilice un micropipette para transferirlas al pozo con solución FBS. Sostenga cada vaso ocular por el nervio óptico y agite boca abajo en la placa de 12 pozos que contiene 1,5 mililitros de 20% FBS en el búfer HBSS HEPES hasta que se logre el desprendimiento completo de las hojas RPE. Recoge cualquier lámina de RPE y racimos RPE con un micropipette, evitando cualquier trozo blanco de esclerótica o coroide, que pueda contaminar los cultivos, y colócalos en un tubo de 15 mililitros.
Tire de dos ojos del mismo ratón en un tubo. A continuación, centrífuga la mezcla RPE a 340 x g durante dos minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Resuspend suavemente el pellet RPE en una mezcla de un mililitro de 0,25% trypsin-EDTA e incubarlo durante un minuto en un baño de agua a 37 grados Celsius para desagregar las hojas de RPE en células individuales.
A continuación, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces, evitando la formación de burbujas. Añadir nueve mililitros de RPE recién preparado medio para diluir e inactivar la trypsin y centrifugar la mezcla a 340 x g durante dos minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspend cuidadosamente el pellet celular en 150 microlitros de medio RPE con 5% FBS.
A continuación, retire PBS de la cámara inferior de la plaquita de membrana recubierta de laminin preparada previamente y agregue 700 microlitros de medio RPE a ella. Retire la laminin de la cámara superior de la plaquita de membrana y distribuya la suspensión de la célula RPE en cuanto a caída y uniformemente al centro de la cámara. Coloque la plaquita de membrana sin perturbar en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante al menos 24 horas.
A continuación, compruebe la inserción de membrana debajo del microscopio para asegurarse de que la mayoría de las células RPE están conectadas a la plaquita y la confluencia es de al menos el 50% No cambie el medio durante las primeras 72 horas. Las células RPE aisladas mediante este protocolo mostraron el tamaño típico de RPE, morfología y pigmentación. Después de una semana se observó una monocapa RPE altamente polarizada con dos núcleos unidos por uniones estrechas, junto con la presencia de microvilli apicales e infoldings basales.
La polarización de la monocapa RPE fue confirmada por los valores TER, con un promedio superior a 200 ohmios centígrados cuadrados, que se mantuvo estable con el tiempo. En los ensayos de fagocitosis realizados en TPV bovino etiquetado FITC, se observó engullimiento y digestión de TPV, lo que indica la formación de una monocapa funcional confluente de células RPE. Las culturas viables requieren un corto tiempo de disección, lo que se logra con experiencia.
Algunas células RPE pueden permanecer unidas a la retina neuronal, pero si varias hojas de RPE permanecen unidas, el protocolo no tendrá éxito. Hialuronidasa fresca debe utilizarse cada vez para prevenir este problema. Estos cultivos celulares RPE de ratón primario funcional son una herramienta valiosa para estudiar la patobiología de la RPE en muchas enfermedades oculares.
Por ejemplo, este protocolo hizo posible estudiar la motos de ruta del RPE en un modelo de ratón de degeneración macular.
