Рыбки данио предлагают ценную модель нейронной регенерации из-за их способности восстанавливаться после травмы спинного мозга. Этот метод описывает выносливость в плавании и поведение в плавании как показания функционального восстановления спинного мозга. Этот метод обеспечивает надежную и количественную оценку выносливости плавания и плавательного поведения у взрослых рыбок данио.
Эти методы в равной степени применимы к исследованиям нервно-мышечного и опорно-двигательного развития, заболеваний и регенерации. Чтобы оценить выносливость к плаванию, откройте программное обеспечение для управления скоростью потока. Нажмите на поле Эксперимент и снимите флажки Uswim и Uwater.
Затем измените скорость потока в коробке Uwater в левом нижнем углу, чтобы отрегулировать скорости течения воды. Чтобы запустить автоматический протокол, щелкните поле Начать ведение журнала. В открывшемся диалоговом окне выберите Автоматически из раскрывающегося списка.
Чтобы открыть ранее сохраненный файл протокола, нажмите на значок файла рядом с файлом протокола. Затем настройте выходной файл, щелкнув значок файла рядом с файлом журнала. В открывшемся окне проводника присвойте выходному файлу имя и сохраните его в нужном месте.
Затем настройте разделенное окно таймера круга, чтобы обеспечить одновременный доступ к программному обеспечению для управления скоростью потока и окнам таймера на экране компьютера. Затем создайте аквариум для сбора рыбы для размещения истощенных рыб после их удаления из плавательного туннеля. Наполните резервуар для сбора и длинную поливинилхлоридную трубку водой системы данио.
Поместите один конец предварительно заполненной трубки в резервуар для сбора, а другой в буферный резервуар, гарантируя, что вода может свободно течь из буферного резервуара в резервуар для сбора. Зажмите верхний конец трубки связующим зажимом, чтобы предотвратить поток воды, и используйте зажим связующего для контроля оттока воды по мере необходимости. Закройте плавательный туннель крышкой для выносливости плавания, прежде чем поместить одну группу рыб внутрь плавательного туннеля.
Чтобы акклиматизировать рыбу к плавательному туннелю и направлению потока, запустите таймер сплит-круга и отрегулируйте текущую скорость до нуля сантиметров в секунду в течение первых пяти минут, девяти сантиметров в секунду в течение следующих пяти минут и 10 сантиметров в секунду в течение следующих пяти минут. После акклиматизации откройте протокол и запустите автоматизированную программу управления скоростью потока, которая будет увеличивать скорость течения воды на два сантиметра в секунду каждую минуту. Следите за рыбой на предмет истощения.
Истощенная рыба будет подталкиваться к заднему концу плавательного туннеля. Чтобы убедиться, что рыба истощена, осторожно постучите по заднему концу туннеля или создайте тень над этой областью, чтобы стимулировать рыбу плавать. Истощенная рыба не реагировала на испуг и лежала ровно в задней части туннеля.
Когда рыба истощится, расстегните трубку для сбора рыбы. Откройте окно плавательного туннеля и соберите рыбу в резервуар для сбора. Запишите время при исчерпании с помощью таймера сплит-круга.
После того, как вся рыба будет истощена и собрана в резервуаре для сбора, нажмите кнопку «Аварийная остановка» на программном обеспечении для управления скоростью потока и остановите таймер. Чтобы снять фильмы для анализа поведения при плавании, поместите группу рыб в плавательный туннель и закройте туннель, используя стандартную, полностью закрытую крышку. Затем откройте новое окно записи и присвойте файлу имя.
Пока не нажимайте кнопку Запись. Прежде чем начать новый эксперимент, поместите бумажное полотенце или кусок ткани на сторону плавательного туннеля, чтобы убедиться, что все поведение связано с плаванием рыб, а не с реакцией испуга, вызванной движением в окружающей среде. Убедившись, что вода спокойная и рябь не движется по кадру, нажмите «Запись» в окне программного обеспечения камеры, чтобы начать запись файла фильма.
Затем нажмите «Пуск» в программном обеспечении для управления скоростью потока, чтобы запустить протокол, который будет продолжаться непрерывно. Посмотрите фильм, чтобы убедиться, что ни один кадр не сбрасывается, в поле зрения нет пузырьков, и все рыбы записаны. Как только запись фильма будет завершена, нажмите «Аварийная остановка», чтобы завершить протокол управления скоростью потока и проверить, что выходной файл данных сохранен автоматически.
Затем закройте окно записи, чтобы сохранить файл фильма. После записи снимите крышку. Осторожно извлеките рыбу и верните ее в свой аквариум.
Чтобы проанализировать захваченные фильмы, откройте tracking_v2. ijm скрипт на Фиджи и нажмите Выполнить, чтобы начать программу. Во всплывающем окне выберите папку, содержащую фильмы о поведении плавания для отслеживания, и нажмите «Открыть».
Найдите кадр одного из первых фильмов, диалоговое окно и регион интереса, или менеджер ROI, который появится. Следуйте указаниям, приведенным в диалоговом окне, и создайте ROI в нижней части камеры плавательного туннеля. Затем нажмите OK и убедитесь, что черные углы не видны.
Откроется пороговое окно вместе с отредактированным пороговым кадром. Измените цветовую схему с черно-белой на красную и отрегулируйте максимальное значение до тех пор, пока первая рамка не покажет рыбу только красным цветом и ничего больше. Запишите пороговое значение и нажмите кнопку ОК в диалоговом окне.
Для выравнивания, сборки и получения описательной статистики откройте SwimBehavior_v7-3. Скрипт R в RStudio и нажмите на Source в правом верхнем углу раздела скрипта. В открывшемся новом окне выберите папку, содержащую _raw.
CSV-файлы, созданные Fiji, и нажмите кнопку Открыть. Программа запустится автоматически. Во всплывающем диалоговом окне подтвердите количество рыб в каждом фильме.
Нажмите Кнопку Да, если указанные цифры верны, или нет, если цифры неправильные. После выравнивания файлов проверьте наличие вновь созданного _aligned. csv файл.
Убедившись, что программа объединяет данные, запускает статистику и строит выходные графики, проверьте наличие файлов анализа, созданных в новой папке с меткой Results в родительской папке, содержащей _raw. csv и _aligned. csv файлы.
Выносливость в плавании, оцененная через две, четыре и шесть недель после травмы, показала 60%-ную потерю выносливости в плавании через две недели. Регенерирующая рыба постепенно восстанавливала выносливость в плавании через четыре и шесть недель после травмы. В анализе поведения при плавании органы управления неуклонно плавали в передней части камеры плавательного туннеля, соответствующей приподнятому положению Y.
Напротив, через две недели после травмы травмированная рыба не могла поддерживать устойчивую способность плавать против течения. Следовательно, их плавательные дорожки более нерегулярны, с общим уменьшением положения Y. Положение Y увеличивалось через четыре и шесть недель после травмы, что указывает на то, что регенерирующие животные постепенно восстанавливали свою способность плавать.
Кроме того, по сравнению с неповрежденными контрольными группами, пораженные животные через две недели после травмы были заметно менее активными, заглохли в заднем квадранте плавательного туннеля и потеряли способность плавать против скоростей слабого течения. В соответствии с их врожденной способностью к достижению функционального восстановления, пораженные животные постепенно нормализовали параметры плавательного поведения через четыре и шесть недель после травмы. Использование программного обеспечения для управления скоростью потока в этом протоколе является необязательным.
Альтернативой является ручное управление двигателем тока воды. Анализы, описанные в этом исследовании, могут быть использованы для предварительного скрининга нервных, мышечных или скелетных фенотипов. Затем интересующая ткань может быть собрана для гистологического или молекулярного исследования.
Наша лаборатория и другие использовали этот протокол для идентификации генов, необходимых для врожденного нервного восстановления, и факторов, достаточных для усиления нейронной регенерации.
