Исследования материнской иммунизации и переноса антител бесценны по многим причинам, поскольку это начальный путь передачи иммунитета и последующей защиты от патогенов и болезней у новорожденных и младенцев. Благодаря сходству плацентации и переноса антител с человеком, кролики являются отличной моделью материнской иммунизации. В этой видеостатье мы демонстрируем методы, которые наша лаборатория использовала в исследованиях материнской иммунизации у новозеландских белых кроликов, включая интраназальную иммунизацию и сбор молока.
Сначала мы опишем пример временной шкалы и серию событий для исследования иммунизации матерей слизистой оболочки у новозеландских белых кроликов. Самки кроликов иммунизируются интраназальным путем, как показано в этом видео. В зависимости от исследования, вакцина может потребовать усиления или может потребоваться введение через дополнительный путь, такой как внутримышечное прививка.
Хотя кровь не изображена, она должна быть собрана до первоначальной иммунизации для исходных измерений и в течение остальной части исследования через регулярные промежутки времени. Кровь легко получается центральной артерией уха с помощью мягкой сакации и местного обезболивающего агента. Наличие антиген-специфических уровней IgG может быть измерено в этих образцах.
Затем разводят кроликов. Мы предпочитаем приобретать проверенных заводчиков у продавцов для использования, чтобы обеспечить более высокий уровень беременности для этих исследований. В зависимости от сроков иммунизации кролики могут получать дополнительные прививки на протяжении всей беременности.
Антиген-специфический IgG переносится трансплацентально в наборы. Примерно через 30-32 дня после размножения беременная будет загощаться. Мы рекомендуем ограничить обработку комплектов в течение первых нескольких дней, чтобы свести к минимуму отказ от нее.
Образцы крови могут быть собраны из наборов для оценки антиген-специфических уровней IgG, которые были переданы трансплацентально. Кровь может быть собрана из небольшого количества наборов во время или около времени рождения для оценки ранних уровней антиген-специфических антител. В дополнение к широкому разнообразию питательных веществ, наборы получают антиген-специфический IgA от лактирующих лань во время кормления.
Наборы обычно отлучают от отлучения от четырех до восьми недель. Перед отъемом молоко можно легко собрать с лактирующих делает, как показано в этом видео. Затем собранные образцы молока обрабатывают для обнаружения антиген-специфического IgA.
В зависимости от исследования, вакцины и буст могут быть введены в наборы, а серийные образцы крови могут быть собраны из наборов в очень раннем возрасте с использованием боковой подкожной вен. Теперь мы продемонстрируем интраназальную иммунизацию и сбор молока в Новозеландском протоколе White Rabbits.Protocol. Все процедуры были одобрены и выполнены в соответствии с политикой Комитета по институциональным уходу и использованию животных Университета Дьюка.
Интраназальная иммунизация. Необходимые материалы: ацепромазин, шприц и игла, офтальмологическая смазка, изофлуран, носовой конус, пипетка и наконечники пипетки, вакцина слизистой оболочки. Подготовьте раствор для иммунизации перед обработкой животных.
Кроликов утомляют ацепромазином один миллиграмм на килограмм внутримышечно, а обезболивают изофлураном с помощью носового конуса. После полного обезболивания, оцениваемого по рефлексу век, офтальмологическая смазка добавляется к каждому глазу, чтобы предотвратить высыхание глаз и последующее изъязвление роговицы. Как только член лаборатории будет готов ввести вакцину, а кролик окажется в адекватной плоскости анестезии, выключите изофлуран и кислород и удалите носовой конус.
Поместите кролика в дорсальную ложную клетку и подпирите шею и голову под углом около 45 градусов, что обеспечивает легкий доступ и визуализацию обоих аларов членом лаборатории, вводимым вакцину. Нагрузите пипетку не более чем 100 микролитрами раствора вакцины и быстро ввести раствор в одну ноздрю и повторить процедуру для второй ноздри. Пипетку следует удерживать под углом примерно 45 градусов.
Угол в сторону медиаального аспекта носового прохода. Цель иммунизации заключается в том, чтобы раствор контактирул со слизистой оболочкой наресов. Таким образом, наконечник не следует помещать в нары, так как это может привести к истиранию или раздражению тканей слизистой оболочки и потенциально повлиять на иммуногенность назально вводимой вакцины.
Вакцина должна быть введена быстро и сделана таким же образом в другой ноздре. После введения в оба носовых прохода кролика поддерживают в дорсальной лежачем состоянии в течение 30 секунд, чтобы свести к минимуму утечку раствора вакцины. Лаборатория обычно вводит не более 100 микролитров на ноздрю за раз.
Если необходимо ввести больший объем с максимальным общим объемом 500 микролитров, вакцина может быть введена в 100 микролитрах аликвоты с 30-секундным периодом отдыха между иммунизациями. И дополнительные введения вакцины повторяют с 30 секундами отдыха между каждым введением до тех пор, пока не будет доставлен общий объем вакцины. После иммунизации поместите кролика на вентиляционную клетку для восстановления и внимательно следите за животным, пока оно не сможет поддерживать стернальную отстойность.
В некоторых случаях вакцинная композиция может быть не полностью доставлена в носовую полость, и часть вакцинной композиции может оставаться на внешней части нарезов. В этом случае, поскольку неясно точный объем вакцины, которая была должным образом доставлена в носовую полость, не рекомендуется повторное применение дополнительного вакцинного материала, поскольку это добавит неопределенную переменную к эксперименту. Важно использовать технику доставки вакцины, которая обеспечивает полную и последовательную доставку состава вакцины в нары.
Сбор молока. Необходимые материалы: ацепромазин, шприцы и иглы, спиртовой тампон, марля, офтальмологическая смазка, изофлуран, носовой конус, окситоцин и флакон для сбора. Кроликов утомляют ацепромазином один миллиграмм на килограмм внутримышечно, а обезболивают изофлураном с помощью носового конуса.
После полного обезболивания, оцениваемого по рефлексу век, офтальмологическая смазка наносится на каждый глаз, чтобы предотвратить высыхание глаз и последующее изъязвление роговицы. Очистите кожу над краевой веной уха спиртовой тампоном. Используя один шприц mil и иглу 25 калибра, вводите примерно одну-две международные единицы окситоцина внутривенно через краевую ушную вену, чтобы вызвать выделение молока.
Из-за расслабления гладких мышц кролик обычно мочится или испражняется после введения окситоцина. После введения окситоцина нанесите давление на место инъекции кусочком марли, чтобы обеспечить гемостаз. Сохраняя анестезионную маску или носовой конус над носом кролика, подпирайте кролика на задние четверти.
В качестве примечания, сбор молока также может быть выполнен с животным в боковом положении, но лаборатория обнаруживает, что сбор легче, когда кролик подпирается на его крестец с помощником, держащим кролика вертикально с маской анестезии. Откройте стерильную трубку, чтобы подготовиться к сбору молока и найти ткань молочной железы и связанные с ней соски. Кролики обычно имеют от четырех до пяти пар молочных желез.
Соски, как правило, окружены влажным мехом от недавнего кормления, а ткань молочной железы легко прощупываются, когда она полна молока. Захватите ткань молочной железы, связанную с соском между большим и указательным пальцами, и нанесите мягкое массирование на железистую ткань в направлении соска. Поместите трубку для сбора над сосок, чтобы собрать сцеженное молоко.
Иногда может потребоваться несколько минут, чтобы окситоцин был эффективным, и производство молока, по-видимому, варьируется среди молочных желез. Если скипия молока не увенчался успехом, подождите несколько минут или поверните вокруг дополнительной молочной железы. Молоко из всех сосок можно собирать в одну мерзкую.
Обычно несколько миллилитров молока можно легко собрать у лактирующих лася. После того, как желаемый объем молока был собран, выключите изофлуран и кислород и удалите носовой конус у кролика, и дайте кролику восстановиться, находясь под тщательным наблюдением, пока животное не сможет поддерживать стернальную лежачку. Репрезентативные результаты.
Рисунок первый. Для материнских исследований определение беременности как можно раньше полезно для подтверждения того, что ладь не нуждается в повторном разведении. Варианты обнаружения беременности включают пальпацию, ультразвук, рентгенограммы, увеличение веса и молекулярные методы, такие как измерения факторов роста инсулина и прогестерона.
Адекватный уровень прогестерона необходим для поддержания беременности у кроликов. Поэтому в нескольких исследованиях также оценивались уровни прогестерона у беременных кроликов и демонстрировались повышенные уровни по сравнению с небеременными кроликами, особенно во время органогенеза в середине беременности. Как показано на рисунке один, повышенные уровни прогестерона могут быть обнаружены у беременных кроликов по сравнению с небеременными кроликами даже после того, как спаривание баксом было подтверждено для всех.
Уровни прогестерона в сыворотке крови измеряли с помощью автоматизированного хемилуминесцентного анализа. Рисунок второй. Антиген-специфический IgG, который был передан трансплацентально во время беременности, может быть измерен в сыворотке наборов Элизой.
Кровь может быть собрана из небольшого количества наборов во время или около времени рождения для оценки ранних уровней антиген-специфических антител. Серийный забор крови технически намного проще, так как наборы стареют и увеличиваются в размерах. Как показано на рисунке два, сывороточные уровни антиген-специфического IgG в наборах можно измерить и сравнить с материнскими уровнями.
Матери перенесенные уровни IgG выше при рождении и со временем снижаются. Рисунок третий. Кроличье молоко может быть собрано, как показано в этом видео, и обработано для измерения общих и антиген-специфических уровней антител с помощью Elisa.
Как показано на этом рисунке, IgA составляет значительную часть общих антител в грудном молоке, которые доступны для пассивного переноса в наборы. Уровни IgA и IgG значительно выше, чем IgM.Summary. В данной видеостатье описано и демпрородемонстрировал введение интраназальных вакцин и сбор молока у лактирующих кроликов в качестве средства оценки иммунитета слизистой оболочки в трансляционно подходящей модели иммунизации матери.
Изображено краткое изображение типичного дизайна исследования интраназальной иммунизации матери, включающего иммунизацию, разведение, расщепление, лактацию и перенос антител.
