Методы, которые мы описываем здесь, были приняты нашим спонсором NIH COBRE, Основным фондом Университета Кентукки, чтобы помочь исследователям производить однолейнные антитела в альпаках. Одно доменные антитела являются важным инструментом, используемым для ответа на ключевые вопросы в биомедицинских исследованиях. Основным преимуществом методов, которые мы демонстрируем, является то, что он позволяет производство одно доменных антител до пяти различных белков в одной альпаке.
Последствия этого метода распространяются на здоровье человека и лечение заболеваний, поскольку эти одно доменные антитела могут быть использованы в качестве терапевтических средств, в качестве вакцин и в качестве диагностики. Наиболее значительным препятствием для большинства установленных биомедицинских исследователей является обращение с крупными животными, такими как альпака. Визуальная демонстрация обработки альпаки, инъекции антигенов и сбор крови имеют решающее значение для успешного производства однодомальных антител в этих верблюдах.
Демонстрация процедуры будет доктор Джефф Смайли, университет ветеринар, г-жа Кэти Боаз, ветеринарный техник, и г-жа Эрин Джонс, Лаборатория животных техник. Обработка крови будет продемонстрирована доктор мартин Чао, научный сотрудник. Реальные истории этой продукции Голубые глаза, Big Boy, или ласково известный как горилла, и Фредди, наши Альпаки Кентукки.
Для начала сдерживайте животное недоуздок и свинцом. Затем обрезать волосы альпаки с электрическими клиперами в полумесяце картины вдоль основания его шеи, с плеча на плечо. Тщательно держите альпаку за голову и шею, и медленно вводить антигены подкожно с 22 калибровочных иглы вдоль основания шеи, вблизи носовых лимфатических узлов.
Выполните пять инъекций примерно по 200 микролитров каждый, примерно на пять сантиметров друг от друга. После этого, контролировать животное в течение 20 минут на наличие признаков анафилаксии. Еженедельно осматривать место инъекции для локализованного воспаления на местах инъекций.
Чтобы извлечь кровь, обрезать волосы альпаки и дезинфицировать место сбора с спиртом тампоны. Сдерживайте альпаку осторожно, гарантируя, что шея удерживается вертикально и прямо. Используя вентральные проекции поперечного процесса позвонков в качестве ориентира, затмить вену, применяя давление только медиальный для брюшного процесса.
Затем вставьте иглу под углом 45 градусов, слегка медиальный к проекции, к центру шеи. Манипулируйте иглой до тех пор, пока кровь не течет. Во-первых, разбавить 15 миллилитров собранной крови пятью миллилитров PBS.
Затем, пипетка крови в лимфоцитов разделения трубки для изоляции периферических лимфоцитов крови, или ПБЛ, через градиентной центрифугации плотности. Аккуратно удалите верхний плазменный слой, сохранив его в отдельной трубке. Затем аккуратно удалите слой PBL и перенесите его в стерильную 50-миллилитровую трубку.
Добавить 45 миллилитров предварительно охлажденных PBS в ПБЛ и спина трубки в течение 20 минут при 800 раз G, и четыре градуса по Цельсию. Удалите супернатант с пипеткой, оставляя гранулы, содержащие лимфоциты. Вымойте гранулы еще два раза с пятью миллилитров предварительно охлажденных PBS, чтобы подготовить ПБЛ для изоляции РНК.
Используя этот протокол, одно доменные антитела были созданы против ряда белковых антигенов. Иммунный мониторинг показал, что большинство антигенов показали надежную реакцию, начиная с трех недель, и что оптимальное время для получения крови составляет шесть недель. Секвенирование положительных колоний выявило различные последовательности антител одного домена для различных антигенов.
Например, три уникальные колонии были изолированы от эталонного антигенного мальтозного связывающего белка. Как правило, однолейнные антитела содержали значительное разнообразие последовательности и весьма переменную длину антиген-связывающих петель. Эти функции особенно важны при одно доменных антителах антигенных взаимодействий.
Эта процедура позволяет вырабатывать одно доменные антитела до пяти антигенов на животное. Для каждого животного используется единая коллекция крови и библиотечное строительство. С фагом на основе выбора используется для выявления антиген-специфических, одноко цепных антител.
Делая инъекции антигена и взятия проб крови, важно держать альпаки в группе, которая сохраняет их спокойнее. Это может быть сделано с помощью недоуздок и приводит, и связывая их в непосредственной близости во время процедур.
