Целью этого протокола является упрощение эксперимента с опосредованным CRISPR/Cas9 в макрофагах и Т-клеточных линиях с помощью флуоресцентных репортеров и влиять на сортировку клеток. ROSA26 Locus известен как геномная безопасная гавань для вставки трансгенов. Обычно экспрессируется интересующих белок с атакой или без нее в мышином мире 26 локусов или в ортологе человека.
Часть 1: Проектирование и плазмидная конструкция sgRNAs, нацеленных на Локус Rosa26. Сначала разработайте sgRNAs из локуса Rosa26 мыши, используя последовательности из информатики генома мыши, и Ensemble Genome Browser, а затем загрузите геномную последовательность гена Rosa26 мыши. Перейдите к онлайн-инструменту CRISPOR, вставьте 100 пар оснований входной последовательности из Rosa26 Locus.
Затем выберите геном, например, Mus musculus-mouse reference genome 2011. Затем выберите тип PAM. Используйте мотив 20bp NGG"PAM, распознаваемый spCas9.
Нажмите кнопку Отправить. Выберите руководство с высоким показателем специфичности, высоким баллом выполнения и меньшим количеством не-мишеней. Следует избегать руководств, указанных как неэффективные.
Примечательно, что предпочтительно выбирать два направляющих с перекрывающимися последовательностями, что может увеличить эффективность выбивания, как сообщается. Для теплой последовательности обеда синтезируют форвардный нелегал и обратный нелегал, который отжигается фосфорированным и готовым к клонированию на фактор. Подготовьте линеаризированное снижение по Vactor, к которому я мог бы выразить то, что я должен репортерировать BBS одно пищеварение, как получить Нила, легальные к линеарализованному вектору для генерации окончательной конструкции, которая одновременно экспрессирует направляющую РНК и девять ядер CAS, связанных с DSRIP двумя флуоресцентными репортерами.
Часть вторая:Построение вектора таргетинга как гомологичного шаблона рекомбинации. Для экспрессии интересуемого белка. Например, человек продержался.
Вы хотите синтезировать последовательность кДНК коммерческим источником, и аффинная метка OST или другая широко используемая атака для очистки белка может быть слита с последовательностью кДНК. Не забудьте включить последовательность консенсуса Казака перед инициацией кДНК. Переваривается ферментом рестрикции Asc1, и как бы получает CD и вставку в позвоночник.
Вактор, а именно пХР26-ИБФП ИБП, дающий конечный таргетный концентрат контейнера, каждый из которых, КБ из пяти простых и трех простых гомологичных ветвей. Набор выражений включает в себя промоутера CG, ресторан UST, если вы хотите, чтобы регион Кунин был связан с Iris, если репортер VFD и поли AC финансирует. Наконец, на горизонте нацеливая вектор с использованием уникальных ферментов реза, таких как EcoR1 или BamH1, дигесты и продукт очищаются в хранилище, которое минус 20 градусов на электропорационные ноты.
Рекомендуется получать высокую концентрацию линеаризированной векторной ДНК. Часть третья: Электропорация линий макрофагов и Т-клеток готовит клеточную культуру с последующим разделением для клеток Geritalk. Оптимальная плотность клеток составляла примерно 0,5 млн клеток на МЛ на момент трансфекции.
Полная электропорация в десяти макро-маленьких ядерных форматах наконечника готовит 24-луночную пластину, содержащую 500 микролитров полного роста, среду без антибиотиков в каждой лунке. Предварительно прогреть пластины в увлажненном 37 градусе, на 5% покрывая эту установку инкубатора. Отключите входные параметры электропорации системы электропорации для струйной кошки или Rosales.
Подготовьте последующую смесь клеточной ДНК или пройдите операцию по сбору куриных клеток. Курчин 25 квадратных сантиметров колбы передают клетки у 15 животных. Так как вы трубку, то Филлип клеток путем центрофугирования в 90 раз G в течение восьми минут при комнатной температуре, попросите его, супернатанты.
Для промывки повторно суспендирует клетки с пятью ML PBS, затем вращайте клеточную суспензию центрифугированием, используя то же условие, что и на предыдущем этапе. Удалите DSP. И повторно суспендировали клеточные подушки, используя два ML DBS.
Вы остаетесь микро маленькой суспензией ячейки и смешиваете с равным объемом 0,2% Трепан Баллу, чтобы оценить количество ячеек нагрузки образца в терминах подсчета слота вставки Конни слайд в автоматизированной ячейке Коннора и просмотра самого изображения. Затем получите результат подсчета ячеек. Расчет 2 млн ячеек позволит найти репутацию электропорации за эксперимент по выбиванию, перевести количество ячеек в 1,5 мл.Центрифугировать две пеллетные ячейки методом центробежной центробежной.
Для экономии времени во время центробежизации можно приготовить электропорационную смесь, которая добавит по 2,5 мкг к каждому из CRISPR CAS девяти векторных 2,4 мкг риса Белинда, разговорчивого вектора и ре суспензии Буффало. Наш общий объем 55 макропометов в новой центрифугированной трубке объемом 1,5 мл мягко вершина и. Ненадолго встаньте, чтобы хорошо перемешать.
Перед использованием оставьте луксорную смесь давления и комнатной температуры. После вращения аспарта, DTB это по существу предохранитель в течение дополнительных 30 секунд, удаляет как можно больше супернатанта повторно подвешивающих ячеек, добавляя приготовленную электропорационную смесь пипетки вверх и вниз осторожно. Электропорация попросила ячейку электропорационного смесителя с использованием 10 микро маленьких ядерных фракций наконечника, была важна пипетки.
Избегайте пузырьков воздуха во время питтинга, это будет стоить отказа гальвана. Нажмите кнопку Пуск. после чего операция переносит образец через некоторое время.
Колодец из 24, пластины скважины с предварительным предупреждением о грубой среде выполняют то же электрическое давление и процедуры, что и выше на оставшихся четырех реплицированных образцах, осторожно раскачивая пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек. Инкубируют клетки в инкубаторе 37 градусов в течение 48-72 часов. До того, как сортировка клеток Через 24 часа после трансфекции, исследуйте экспрессию нарушения двух для ресторанного репортера с помощью флуоресцентной микроскопии, отделенной от представителя для нас самих, показывает, что электропорация работает должным образом.
Часть 4: сортировка клеток для изоляции мнимых выбивающихся клеток. Перед приготовлением клеточной сортировки в 96 пластинах скважины со 150 мкм специфической грубой среды клеточного типа на скважину используют неправильное нижнее микро место для культуры и себя и плоское нижнее микро место для всех клеток переносят ячейки в стерильный FACS, чтобы держать трубку на льду и поместить коробку в путь через окно, подключение к камере сортировки ячеек, когда применимо установить сортировщик клеток с соплом 85 микрометров и низкой скоростью потока для сортировки иммунных клеток для достижения оптимальной оценки и выживаемости клеток, взять образцы из вершины сквозного окна ненадолго и загрузить образец в приобретения. Чампер настроил катание фактов для сортировки клеток, сначала определил воронки продаж для рассеяния Форда и бокового рассеяния, а затем определил жизненные ячейки, получив набор разговоров красных отрицательных клеток.
Затем они находят живые одиночные клетки с помощью одиночного синглетного гаширования с использованием FSC H против FSE многомиллионного блока. Наконец, установите ворота для желаемых DSR два и B, если Volvo положительная субпопуляция, которая указывает на то, что клетки успешно ко трансфекционированы вектором CRISPR и вектором карманирования. Таким образом, 10 одиночных клеток в каждой скважине из 96, хорошо заполненной пластиной, дополненной дожимом, полной средой роста с использованием режима периода или режима одной клетки после сортировки инкубируют 96, колодезные пластины в инкубаторе клеточной культуры для расширения клеток.
Часть пятая: скрининг повышения положительных клеток после примерно двух недель клеточного расширения после выживания клетки в 48-хорошей пластине оценивают экспрессию BFP или проточной цитометрии, используя небольшую долю пролиферата, используя клетки типа стенки в качестве отрицательных популяций контрольных клеток, обладающих более высоким процентом положительных клеток BFP, сохраняются для выполнения валидации экстракта геномной ДНК из клеток, которые мы должны экспрессировать BFP пропускают изолированную геномную ДНК с помощью ПЦР с праймерами, охватывающими каждую сторону гомологичных рукавов, а именно один первичный находится в геномной последовательности, внешне к вектору нацеливания. Видимая сторона разговора с вектором в этом эксперименте, предсказанный размер продукта ПЦР, амплифицированного с первичным, составляет 1,2 кВ. А с F два и R два — 1,2 КБ результатов секвенирования Сэнгера. Таким образом, продукты ПЦР показывают последовательности каждого интеграционного перехода, демонстрируя правильное и стучающее положение в Rosa 26 Lucas.
Я говорю, что иммуноблоттинг позволяет проверить правильное стук на уровне белка часть шести репрезентативных результатов. В качестве примера, опубликованного в предыдущем исследовании, мы выразили, что получают 45 молекул, которые прилипают к интеру с osd-меткой, и было 26 локусов в проверке Т-клеток впоследствии USD такта. Я получаю 45 и падающие директора или стянутые вниз аффинной очисткой и предмет масс-спектрометрии.
В их протеомических данных выявлено взаимодействие Т-клеток. Поэтому этот пул продуктов значительно облегчил поиск новых интеркаляторов для выяснения функции данного белка. Эта техническая презентация показала, что путем переходно выраженного увеличения на линию литья RFP с говорящим вектором ко-экспрессированного и BFP для локуса Rosa 26.
Мы создали выбивающие клеточные линии с постоянной экспрессией генов как в Т-клетках, так и в макрофагах, которые трудно выполнять при генетических манипуляциях. Эти методы и рекомендации применимы к Крису, разрешенные в утверждениях о большом сегменте ДНК для механистических исследований иммунных клеток, таких как для идентификации белка, исследования белкового взаимодействия.
