Дендритные клетки, или ДК, являются ключевыми иммунными клетками, связывающими врожденную и адаптивную иммунную систему. Хотя DC неоднородны, этот метод помогает нам понять, какие гены, включая факторы транскрипции, могут регулировать развитие DC. Этот метод обеспечивает простой и быстрый способ идентификации гена, который контролирует развитие DC от их прародителя in vitro.
Для начала поддерживайте увековеченные гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки или iHSPC в полной среде RPMI 1640, дополненной 100 нанограммами на миллилитр лиганда FLT3 и одним микромолярным бета-эстрадиолом. Для лентивирусной трансдукции пластинчат iHSPC в 12 луночных пластинах с плотностью от одного раза 10 до пятой клетки на лунку и один миллилитр полной среды, содержащей лиганд FLT3, бета эстрадиол и полибрен. Затем добавьте лентивирус, несущий короткую РНК шпильки в каждую лунку при множественности инфекции 100.
Затем раскрутите пластину в 1100 раз г и 37 градусов цельсия в течение 90 минут, затем инкубируйте зараженные клетки на ночь при 37 градусах Цельсия. На следующий день удалите полибрен, собрав клетки в 15 миллилитровые трубки при центрифугировании, после замены среды свежей полной средой, содержащей лиганд FLT3 и бета-эстрадиол. Через дополнительные 24 часа добавьте шесть микрограммов на миллилитр пуромицина в среду, чтобы отобрать инфицированные клетки.
Заменяйте селекционную среду каждые три дня и поддерживайте клетки в течение не менее одной недели, чтобы расширить стабильно трансдуцированные iHSPC. Генерировать и поддерживать стабильные нокдаунные iHSPC для LacZ, Tcf4 и Id2 в полной среде, дополненной лигандом FLT3 и бета-эстрадиолом. Чтобы инициировать дифференцировку in vitro, соберите недифференцированные iHSPC в 15-миллилитровые трубки и гранулируйте клетки центрифугированием.
После центрифугирования выбросьте супернатант и дважды промыть клетки 10 миллилитрами PBS. После второй промывки повторно суспендируют клетки в полную среду, содержащую только лиганд FLT3, затем высевают их с плотностью в два раза 10, чтобы пятый продавался на миллилитр в 12-луночную пластину. Через три дня добавить один миллилитр свежей полной среды, содержащей лиганд FLT3.
Через дополнительные два дня приступайте к анализу дифференцированных клеток методом проточной цитометрии. Для проточного цитометрического анализа пипеткой клетки вверх и вниз два-три раза в пластине, а затем собирают клетки в трубки по 1,5 миллилитра. Центрифугируйте трубки и выбросьте супернатант перед повторным использованием ячеек в 50 микролитрах факсимильного буфера.
Затем добавьте 50 микролитров анти-CD16 на 32 гибридомы супернатанта и инкубируйте в течение пяти-10 минут на льду. Затем добавьте флуоресцентные краситель-конъюгированные антитела непосредственно к клеткам и высиживайте в течение 15 минут на льду в темноте. После инкубации промыть клетки одним миллилитром факсимильного буфера и центрифугировать образец.
После центрифугирования повторно суспендируют ячейки в 100 микролитрах факсимильного буфера и анализируют образцы методом проточной цитометрии. После короткого нокдауна LacZ, Tcf4 и Id2 в iHSPCS, подтверждение эффективности нокдауна с помощью RTQ-PCR показало, что экспрессия нокдаун iHSPC Tcf4 и Tcf4 была снижена по сравнению с таковой в нокдаунных iHSPC LacZ. Аналогичные результаты наблюдались для выражения Id2 в нокдаунных iHSPC Id2.
После культивирования LacZ нокдаун iHSPC в течение пяти дней частота CD11c-положительных клеток, которые представляют собой популяцию дендритных клеток, составила около 95%Однако сбивание Tcf4 или Id2 немного уменьшило генерацию CD11c-положительных дендритных клеток. Дальнейший анализ CD11c-положительных дендритных клеток, полученных из нокдаунных iHSPC LacZ, показал, что 70% были обычными дендритными клетками, а 22% были плазмацитоидными дендритными клетками. Нокдаун iHSPC Tcf4 генерировал значительно более низкий процент плазмоцитоидных дендритных клеток, которые контролирует нокдаун LacZ.
Напротив, нокдаун iHSPC Id2 генерировал значительно более низкий процент обычных дендритных клеток, чем контроль нокдауна LacZ, но более высокий процент плазмоцитоидных дендритных клеток. Спиновые инфекции повышают эффективность трансдукции лентивирусно-несущей шРНК в iHSPC. Этот метод рассматривает роль факторов транскрипции и облегчает изучение других генов в передаче сигналов цитокинов или метаболизме, которые, вероятно, будут участвовать в развитии DC.
