Это видео демонстрирует производство и применение точных ломтиков печени в качестве экспериментальной модели ex vivo биологии тканей печени. Точность вырезать ломтики печени занимают экспериментальную нишу, которая существует между in vivo исследований на животных и в пробирке методов культуры клеток. Этот метод имеет несколько ключевых преимуществ по поводу in vivo исследований на животных, в том числе способность использовать контроль и лечение образцов из той же печени, изоляция тканей печени, чтобы удалить внецелевые эффекты из других систем органов, и способность использовать реагенты, которые могут иметь негативный эффект при применении к целому живой мыши, например, токсичные ингибиторы пути.
Техника включает в себя использование бокового вибрирующего лезвия, чтобы сократить ультра-тонкие, кусочки печени жизнеспособной ткани печени следуют лабораторной культуры тканей. Вибрации лезвия предотвращает разрыв, вызванный стрессом стрижки. В этом примере, мы покажем методы для подготовки жизнеспособных ex vivo ломтики печени, и продемонстрировать полезность печени ломтик культуры в примерах экспериментов, где это ex vivo ткани рассматривается с желчными кислотами, чтобы стимулировать холестатической травмы печени для оценки механизмов печеночной фиброгенез.
Вставьте лезвие в режущие руки. Дезинфицировать лезвие и режущие руки с 70%этанола раствора. Всегда будьте осторожны, чтобы избежать контакта с лезвием.
Дезинфицировать буферный лоток раствором 70%этанола и протереть стерильной тканью. Вставьте буферный лоток в виброметр и затяните монтажный винт. Установите режущие руки на максимально доступную высоту.
Проверьте угол лезвия. На нашем виброме мы используем 10-градусный угол от горизонтального, с лезвием, наклонным вниз к образцу. Убедитесь, что угол лезвия плотно закреплен.
Дезинфицировать держатель образца, опять же, с 70%этанола раствора. Соедините охлаждающую воду для термоэлектрического охладителя Peltier, расположенного под буферным лоток. Некоторые модели вибратомии используют ледяную ванну для охлаждения вместо этого.
Зафиксите трубку для полива до стока и включите воду. Установите кулер до четырех градусов по Цельсию. Добавьте в буфер буфер буфера «Кребс-Хенселейт» с холодным льдом.
Все хирургические инструменты и материалы должны быть стерильными. Мышей следует глубоко обезболить или усыоть. Поверхности кожи на мышах были дезинфицированы путем смачивания с 70%этанолового раствора.
Сделайте разрез средней линии в кожу от основания брюшной полости до диафрагмы. Используя чистые типсы и ножницы, откройте брюшную полость. Удалить печень быстро, не повреждая доли.
Нажмите печень вниз, и сократить соединительной ткани в верхней части печени. Нажмите печень вверх. Держите центральную сосудистую область печени типсами и потяните вверх.
Вырезать соединительной ткани кровеносных сосудов. Позаботьтесь, чтобы не повредить доли печени, а также, заботиться, чтобы не нарезать желудочно-кишечного тракта. Поместите удаленную печень в стерильное блюдо ледяного буфера Кребс-Хенселейт.
Разделив печень на отдельные доли. Выберите одну долей печени и поместите плоскую сторону вниз на новое стерильное блюдо. Держите другие доли на льду в буфере Кребс-Хенселейт.
Обрежьте края долей печени. Обрезка имеет важное значение, особенно на краю, который будет контактировать с передний лезвие во-первых, как имеющие ткани края относительно перпендикулярно режущей лезвие предотвратит сжатие тканей, которые могут произойти под мелкими углами. Резка ткани вокруг трех других краев удаляет большую часть волокнистых капсул на краю ткани, и, как правило, позволяет легче удаления тканей ломтиками.
Поместите тонкий слой цианоакрилатного клея на передний край держателя образца, немного больше, чем обрезанные доли печени. Удалите остатки буфера из ткани с помощью стерильного абсорбентного материала. Поместите долей печени на цианоакрилат клей, с самым большим краем, обращенный к передней.
Разрешить вылечить в воздухе в течение одной-двух минут. Поместите ткань, прикрепленную к держателю образца, в вибром. Установите скорость вибромы.
Опустите режущие лезвия, пока он не расположен чуть выше доли печени. Вы запустите вибрирующую режущей руку над образцом. Вибрация лезвия на этой машине активируется педалью ноги.
Верните лезвие назад и опустите высоту лезвия на 250 микрометров. Повторите этот процесс до тех пор, пока верхний слой ткани не будет удален. Отбросьте первый один или два ломтика, так как они будут содержать капсулу Глиссона, и, следовательно, не будет содержать много функциональной ткани печени.
Чтобы сократить ломтики печени, медленно продвигать вибрирующий лезвие в ткани, повернув ручку. Используйте небольшую кисть, чтобы мягко направлять ткани во время процесса резки. Используйте кисть, чтобы забрать разрез ткани разделе, а затем поместить часть ткани в стерильную трубку, содержащую Кребс-Хенселейт буфер для хранения.
Когда он не используется, держите эту трубку на льду. Некоторое время, ткань разрыв во время процесса резки, но для большинства целей, ткани по-прежнему можно работать. Вырезать ломтики ткани до тех пор, пока вблизи цианоакрилата клея.
Не нарезайте клей. Повторите с другими долями печени, которые сидят на льду, пока не будет получено необходимое количество ломтиков ткани. Для очистки держателя образца, либо использовать лезвие, чтобы очистить клей ткани смеси покинуть, или смесь может быть смягчена с помощью растворителей, таких как ацетон или диметиловый сульфоксид.
В капюшоне культуры ткани, pipette одно mL средства Williams'E содержа сыворотку быка плода и противомикробные препараты в плиту 12-наилучшим образом. Удалите ломтики ткани, аккуратно закрученных смесь и наконечник в стерильную тарелку. Разрежьте ткань примерно на однородный размер.
В этом примере мы нацелились на ломтики тканей площадью около 50 миллиметров. Позаботьтесь, чтобы изучить ломтики ткани для консистенции. Темные ломтики предполагают, толщина ткани увеличивается, и должны быть отброшены.
Легкие ломтики предполагают наличие вылеченного клея цианоакрилата, и должны быть отброшены. Перенесите ломтики ткани на пластину из 12 колодец, содержащую один миллилитр мультимедиа. Инкубировать ломтики печени в нормальных условиях культуры тканей.
Если возможно, используйте методы для повышения доступности кислорода к ломтикам тканей. На следующий день после, изменить средства массовой информации с помощью ручной пипетки, чтобы предотвратить потерю ткани путем всасывания. Точность вырезать ломтики печени в настоящее время готовы к экспериментальному использованию.
Для нашего применения, мы обработали ломтики печени с желчными кислотами в течение двух дней, и гомогенизированы в буфере лиза для извлечения РНК посыльного и qPCR анализа. Чтобы изучить жизнеспособность точного сокращения ломтиков печени с течением времени, мы использовали уровни АТФ в качестве прокси для жизнеспособности клеток. Уровни АТФ нормализовались до белка и измерялись в нескольких точках времени после изоляции.
Уровни АТФ были снижены в ближайших и часовых пробах, однако это было восстановлено на три часа. После этого уровни СПС сохранялись в течение пяти дней, хотя со временем они тенденции к снижению. H и E окрашивание было использовано для изучения точности сократить ломтики печени, которые были сохранены в культуре на срок до пяти дней.
Ткань морфологии наводит на себя некоторые некроз происходит на второй день, с тяжелым некрозом происходит на пятый день. Из-за некроза происходит между днями два и пять, мы рекомендуем экспериментальной полезности этого метода ограничивается около трех дней. Однако, это смогло быть увеличено путем использование более лучших методов поставкы кислорода к ломтикам ткани.
Точность вырезать ломтики печени также, как представляется, утолщение коллагеновых волокон по отношению к времени в культуре. Это наводит на зрения спонтанных фиброгенных процессов, происходящих. В примере эксперимента, точность сократить ломтики печени были обработаны тремя отдельными желчными кислотами в течение двух дней, чтобы имитировать печеночного холестаза.
Глядя на экспрессию мРНК трех генов, специфичных для холангиоцитов, две конъюгированные желчные кислоты, гликохольные и таурохольные кислоты, значительно увеличили экспрессию как цитокератина-19, так и коннектина-43. Это согласуется с развитием холангиоцитов. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как создать точность вырезать ломтики печени, и как выполнять основные культуры тканей.
Точность вырезать ломтики печени могут быть использованы для очень широкого спектра применений, в том числе экспериментальных исследований в экспрессии РНК, экспрессии белка, эпигенетики, связывания ДНК, метаболизм, инфекционные механизмы, вторжение рака, фармакология, биология клеток, и секреции исследований, просто назвать несколько.
